Nuus

Dankie dat jy Nature.com besoek het.Die blaaierweergawe wat jy gebruik het beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer).In die tussentyd, om volgehoue ​​ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Kankerselle het verskeie meganismes ontwikkel om sellulêre stres te oorkom en voort te gaan om te vorder.Proteïenkinase R (PKR) en sy proteïenaktiveerder (PACT) is die aanvanklike reageerders wat verskeie stresseine monitor wat lei tot inhibisie van selproliferasie en apoptose.Die regulering van die PACT-PKR-weg in kankerselle bly egter grootliks onbekend.Hier het ons gevind dat lang nie-koderende RNA (lncRNA) aspartyl tRNA sintetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) direk betrokke is by die inhibisie van die PACT-PKR pad en kankersel proliferasie bevorder.Deur gebruik te maak van grootskaalse funksionele sifting van CRISPRI 971 kankergeassosieerde lncRNA, het ons gevind dat DARS-AS1 geassosieer word met aansienlik verbeterde kankerselproliferasie.Daarom inhibeer DARS-AS1-uitklop selproliferasie en bevorder kankersel-apoptose in verskeie kankersellyne in vitro en verminder tumorgroei in vivo aansienlik.Meganies bind DARS-AS1 direk aan die PACT-aktiveringsdomein en voorkom PACT-PKR-interaksie, waardeur PKR-aktivering, eIF2α-fosforilering, en apoptotiese seldood inhibeer.Klinies word DARS-AS1 wyd uitgedruk in veelvuldige kankers, en ooruitdrukking van hierdie lncRNA is 'n aanduiding van 'n swak prognose.Hierdie studie toelig kankerspesifieke regulering van die PACT-PKR-weg deur DARS-AS1 lncRNA en verskaf nog 'n teiken vir kankerprognose en behandeling.
Die vermoë om by stres aan te pas is 'n belangrike kenmerk van kankerseloorlewing en -proliferasie.Die vinnige verspreiding en metaboliese kenmerke van kanker bereik 'n hoogtepunt in moeilike mikro-omgewings - voedingstofdeprivasie, hipoksie en lae pH - wat sellood seinweë kan veroorsaak.Disregulering van stres-sensitiewe gene soos p535, hitteskokproteïene 6, 7, KRAS8, 9 en HIF-110, 11, 12, 13 word gereeld in kanker waargeneem, wat apoptose blokkeer en oorlewing bevorder.
Proteïenkinase R (PKR) is 'n belangrike stressensor en subeenheidkinase van eukariotiese inisiasiefaktor 2α (eIF2α), 'n translasiereguleerder wat sellulêre stres aan seldood verbind.PKR is oorspronklik geïdentifiseer as 'n antivirale proteïen deur die opsporing van 'n vreemde dubbelstring-RNA (dsRNA).By aktivering fosforileer PKR eIF2α om virale en sellulêre proteïensintese te inhibeer14,15,16.PACT (PKR-aktiveerderproteïen) is geïdentifiseer as die eerste PKR-aktiveerderproteïen in die afwesigheid van dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Deur direkte interaksie met PKR, dra PACT verskeie spanninge (serumhongersnood, peroksied- of arsenietbehandeling) oor na PKR en stroomaf seinweë.Benewens eIF2α-fosforilering, veroorsaak PACT-gemedieerde PKR-aktivering verskeie gebeurtenisse wat met die stresreaksie geassosieer word, insluitend veranderde redoksstatus via die PI3K/Akt24-weg, verbeterde DNA-skadekontrole via p5325,26 en NF-κB27,28 Reguleer transkripsie, 29. Gegewe hul kritieke rol in stresreaksie, proliferasie, apoptose en ander sleutel sellulêre prosesse, is PKR en PACT belowende terapeutiese teikens vir baie siektes, veral kanker30,31,32,33.Ten spyte van hierdie pleiotropiese funksionele en biologiese betekenis, bly die regulering van PACT/PKR-aktiwiteit in kankerselle egter ontwykend.
lncRNA's is transkripsies groter as 200 nukleotiede met geen proteïenkoderende potensiaal nie.Sedert die nuutste heelgenoomvolgordebepalingsprojekte duisende lncRNA's geïdentifiseer het, is daar baie moeite gedoen om hul biologiese funksies toe te lig.'n Groeiende hoeveelheid navorsing het getoon dat lncRNA's betrokke is by baie biologiese prosesse37 insluitend die regulering van X-chromosoom-inaktivering38,39, inprenting40, transkripsie41,42, translasie43 en selfs kankergroei44,45,46,47.Hierdie studies het gerapporteer dat baie lncRNA's betrokke is by die PACT/PKR-weg.Een so 'n studie het getoon dat lncRNA ASPACT PACT-transkripsie geïnhibeer het en kernretensie van PACT mRNA verhoog het.Ander studies het getoon dat lncRNA nc886 aan PKR bind en die fosforilering daarvan inhibeer49,50.Tot dusver is lncRNA wat PACT-gemedieerde PKR-aktivering reguleer nie aangemeld nie.
Aspartyl-tRNA sintetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) is geïdentifiseer as 'n onkogene lncRNA51,52,53,54.Deur die regulering van miP-194-5p53, miP-12952 en miP-532-3p51, is getoon dat DARS-AS1 die groei van onderskeidelik duidelike nierselkarsinoom, skildklierkarsinoom en nie-kleinsellongkarsinoom bevorder.Tong en kollegas het ook gevind dat DARS-AS1 myeloom-vordering bevorder deur die stabiliteit van die proteïen 39 (RBM39) RNA-bindende motief te handhaaf.Geen studies is egter gedoen oor of hierdie lncRNA betrokke is by die regulering van PACT-PKR aktivering en die stresreaksie van kankerselle nie.
Hier het ons 'n grootskaalse verlies-van-funksie-skerm uitgevoer met behulp van die CRISPRI-stelsel en vasgestel dat DARS-AS1 lncRNA die proliferasie van verskeie tipes kankerselle bevorder.Daarbenewens het ons 'n belangrike meganisme geïdentifiseer: DARS-AS1 bind direk aan PACT, inhibeer PACT en PKR binding, voorkom fosforilering van eIF2α, 'n laer PKR substraat, en inhibeer uiteindelik apoptotiese seldood.Ten slotte, ons werk onthul die DARS-AS1 lncRNA as 'n reguleerder van die PACT-PKR pad en 'n potensiële teiken vir kankerbehandeling en prognose.
Uitgebreide genomiese profielstudies het honderde lncRNA's geïdentifiseer wat met kanker geassosieer word.Hulle funksie bly egter grootliks onbekend56.Om belowende lncRNA-kandidate wat betrokke is by kankerprogressie te identifiseer, het ons 'n verlies-van-funksie-skerm uitgevoer vir verminderde proliferasie in die SW620 kolorektale kankersellyn deur die CRISPRi-stelsel te gebruik (Fig. 1a).Die unieke kenmerk van die SW480 en SW620 kolonkankersellyne is dat hulle afkomstig is van primêre en sekondêre gewasse in 'n enkele pasiënt.Dit bied 'n waardevolle vergelyking vir die bestudering van genetiese veranderinge in die vordering van gevorderde kolonkanker.Daarom het ons die transkriptome van kolorektale kankersellyne (SW480 en SW620) ontleed deur RNA-volgordebepaling te gebruik en 'n paar potensiële funksionele lncRNA's uit die gepubliseerde literatuur versamel.Gebaseer op hierdie resultate, het ons 'n saamgevoegde sgRNA-biblioteek ontwerp wat 7355 sgRNA-oligo's bevat wat 971 kankergeassosieerde lncRNA's en 500 ongeteikende sgRNA-oligo's teiken vir 'n negatiewe beheer (Aanvullende Data 1).
Skematiese voorstelling van sifting deur die CRISPRi-stelsel te gebruik.b sgRNA-verryking na sifting.Die horisontale stippellyn verteenwoordig log2 (vouverandering) = ±0.58.Die vertikale stippellyn dui p-waarde = 0.05 aan.Swart kolletjies verteenwoordig nie-teiken sgRNA (aangewys as NC).Rooi kolletjies is sgRNA's wat DARS-AS1 teiken.Blou kolletjies is sgRNA's wat LINC00205 teiken, 'n voorheen beskryfde onkogene lncRNA.vouverandering = (genormaliseerde lesing, dag 17)/(genormaliseerde lesing, dag 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown het selgroei geïnhibeer.Foutstawe verteenwoordig ± standaardafwyking van die drie eksperimente.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 tweestert Student se t-toets.d DARS-AS1 uitdrukking in gewasse (TCGA datastel).em Uitdrukking van DARS-AS1 in gepaarde normale en tumormonsters van pasiënte met onderskeidelik BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP en COAD (TCGA-datastel).p-waardes is verkry met behulp van gepaarde tweestert Student se t-toets.
Nadat ons die plasmied gekonstrueer en die lentivirus verpak het, het ons die dCas9-SW620 kolorektale kankersellyn met die bogenoemde biblioteek in vier onafhanklike infeksie-eksperimente oorgedra.Die veelvuldigheid van infeksie (MOI) vir hierdie infeksies was 0.1-0.3, wat aandui dat elke sel slegs met een sgRNA getransfekteer kan word.Na 18 dae van in vitro-kultuur het die verrykingsprofiel van teiken-sgRNA's afgeneem of toegeneem na sifting, terwyl die aantal nie-geteikende kontrole-oligonukleotiede relatief onveranderd gebly het in vergelyking met die voor-siftingsprofiel, wat aandui dat ons teiken 'n hoogs skermspesifieke het biblioteek.Rys.1b en aanvullende tabel 1). LINC00205, wat voorheen berig is om longkanker en lewerkankerprogressie58,59,60 te bevorder, is uitgesif (log2 (vouverandering) <-0.58, p-waarde <0.05), wat die betroubaarheid van hierdie sifting bevestig (Fig. 1b). LINC00205, wat voorheen berig is om longkanker en lewerkankerprogressie58,59,60 te bevorder, is uitgesif (log2 (vouverandering) <-0.58, p-waarde <0.05), wat die betroubaarheid van hierdie sifting bevestig (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, wat voorheen aangemeld is om die vordering van longkanker en lewerkanker58,59,60 te bevorder, is uitgesluit (log2 (vou verandering) <-0.58, p-waarde <0.05), wat die robuustheid van hierdie sifting bevestig (Fig. .1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0.58 ， P 值 <0.05） ， 了 了 该 筛选 的 可靠性 可靠性 eg 图 1b）。。。。 Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0.58 ， P 值 <0.05） ， 了 了 该 筛选 的 可靠性 可靠性 eg 图 1b）。。。。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, wat voorheen berig is om long- en lewerkankerprogressie58,59,60 te bevorder, is uitgesluit (log2 (vouverandering) <-0.58, p-waarde <0.05), wat die robuustheid van hierdie sifting bevestig (Fig. .1b).
Onder al die lncRNA's wat getoets is, is DARS-AS1 ook gekeur, met die drie verwante sgRNA-oligonukleotiede wat aansienlik verminder is na 18 dae van kultuur, wat daarop dui dat die afbreek van hierdie lncRNA tot verminderde kankerproliferasie gelei het (Fig. 1b).Hierdie resultaat is verder ondersteun deur MTS-analise in kolorektale kankerselle wat toon dat die groeitempo van DARS-AS1-afslaanselle slegs gehalveer is in vergelyking met kontroleselle (Figuur 1c) en was in ooreenstemming met vorige verslae van verskeie ander kankertipes.: duidelike sel nierkanker, skildklierkanker en nie-kleinselle longkanker51,52,53,55.Die funksie en molekulêre meganismes daarvan in kolorektale kanker bly egter onontgin.Daarom het ons hierdie lncRNA gekies vir verdere studie.
Om DARS-AS1-uitdrukking by pasiënte te bestudeer, het ons 10 327 tumormonsters van die Cancer Genome Atlas (TCGA)-projek volledig ontleed.Ons resultate toon dat DARS-AS1 wyd uitgedruk en aansienlik opgereguleer word in gesonde selle in 'n verskeidenheid van gewasse, insluitend kolon adenokarsinoom (COAD), renale duidelike sel karsinoom (KIRC), en nier papillêre sel karsinoom (KIRP)..Baie min (Fig. 1d en Aanvullende Fig. 1a, b). Ontleding van gepaarde gesonde/tumormonsters het verder 'n aansienlik hoër uitdrukking van DARS-AS1 in die gewasse van blaas-urotheelkarsinoom (BLCA), niernier-helderselkarsinoom (KIRC), prostaat-adenokarsinoom (PRAD), long-plaveiselkarsinoom (LUSC) bevestig. , baarmoederkorpus endometriale karsinoom (UCEC), long adenokarsinoom (LUAD), lewer hepatocellulêre karsinoom (LIHC), nier nier papillêre sel karsinoom (KIRP), en kolon adenokarsinoom (COAD) (p waarde < 0,05) (Fig. 1e–m) . Ontleding van gepaarde gesonde/tumormonsters het verder 'n aansienlik hoër uitdrukking van DARS-AS1 in die gewasse van blaas-urotheelkarsinoom (BLCA), niernier-helderselkarsinoom (KIRC), prostaat-adenokarsinoom (PRAD), long-plaveiselkarsinoom (LUSC) bevestig. , baarmoederkorpus endometriale karsinoom (UCEC), long adenokarsinoom (LUAD), lewer hepatocellulêre karsinoom (LIHC), nier nier papillêre sel karsinoom (KIRP), en kolon adenokarsinoom (COAD) (p waarde < 0,05) (Fig. 1e–m) .Ontleding van gepaarde gesonde/tumormonsters het ook beduidend hoër uitdrukking van DARS-AS1 in blaas-urotheelkarsinoom (BLCA), duidelikeselnier- en nierselkarsinoom (KIRC), prostaatadenokarsinoom (PRAD), long-plaveiselkarsinoom (LUSC) gewasse bevestig., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , endometriale karsinoom van die corpus uteri (UCEC), adenokarsinoom van die long (LUAD), hepatosellulêre karsinoom van die lewer (LIHC), papillêre selkarsinoom van die nier (KIRP), en adenokarsinoom van die kolon (COAD) (p waarde < 0,05) (Fig. 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 了 dars-as1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (BLCA) 、 肾 肾 透明 细胞癌 (KIRC) 、 前列 腺腺癌 (Prad) 、 肺鳞状 细胞癌 (LUSC) 肿瘤 中 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （UCEC） ， 肺腺癌 （LUAD） ， 肝肝 细胞癌 （LIHC） ， 肾 肾 乳头状 细胞癌 （KIRP） 和结肠腺癌 （COAD） （P 值<0.05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌 细胞癌(Lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（UCEL） 肺腺癌 （LUAD） 肝肝 细胞癌 （LIHC） 肾 肾 乳头状 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Ontleding van gesonde/tumor-gepaarde monsters het verder die rol van DARS-AS1 in blaas uroteliale karsinoom (BLCA), duidelike sel nier sel karsinoom (KIRC), prostaat adenokarsinoom (PRAD), en long plaveisel sel karsinoom (LUSC) gewasse ondersteun.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). uitdrukking in corpus uteriene karsinoom (UCEC), long adenokarsinoom (LUAD), hepatosellulêre karsinoom (LIHC), nier papillêre sel karsinoom (KIRP), en kolon adenokarsinoom (COAD) (p waarde <0.05) (Figuur 1e -m).Saamgevat dui hierdie resultate daarop dat DARS-AS1 wyd en hoog uitgedruk word in 'n verskeidenheid kankers.
Omdat DARS-AS1 en DARS (die geen wat die antisense-string kodeer) dieselfde promotor deel en langs mekaar geleë is, het ons shRNA ontwerp om spesifiek DARS-AS1 uit te skakel, maar nie DARS nie (Aanvullende Fig. 2a,b en Aanvullende Tabel 2). .Benewens SW620, het ons ook drie ander sellyne gebruik wat DARS-AS1 hoogs uitdruk om die doeltreffendheid en funksie van shRNA-afbreek te bestudeer (Aanvullende Tabel 3).Ons resultate het aangedui dat al drie shRNA's wat ontwikkel is, ten minste 80% DARS-AS1-afbreekdoeltreffendheid behaal het met min effek op die hoeveelheid DARS-mRNA (Aanvullende Fig. 2c-f).Daarbenewens het ons gevind dat DARS-AS1-afslag met hierdie shRNA's selgroei in kolorektale kankersellyne SW620 (49.7%) en HCT116 (27.7%), borskankersellyn MBA-MD-231 (53.4%) aansienlik geïnhibeer het.) en die HepG2 hepatoomsellyn (92.7% vermindering), asook hul vermoë om ongeankerde sfere te vorm (gemiddelde vermindering van ~50.8%, 44.6%, 40.7% en 75.7% per sellyn) (Fig. 2a,b).In SW620 het die resultate van die kolonievormingstoets verder bevestig dat DARS-AS1 shRNA selproliferasie aansienlik geïnhibeer het met 'n gemiddelde afname van ongeveer 69.6% (Fig. 2c).
Effek van beheer shRNA en DARS-AS1 shRNA op selproliferasie (a) en sferoïedvorming (b) in SW620, HCT116, MBA-MD-231 en HepG2 selle.c Effek van kontrole shRNA en DARS-AS1 shRNA op kolonie vorming in SW620 selle.Selproliferasie (d), sferoïedvorming (e) en kolonievorming (f) van SW620-selle wat DARS-AS1 ooruitdruk.Getoonde data is die gemiddelde ± standaardafwyking van drie eksperimente.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, en *** p ≤ 0.001 deur tweekantige Student se t-toets.
Om verlies-van-funksie studies aan te vul, het ons volgende SW620-selle geskep wat DARS-AS1 ooruitdruk (Aanvullende Fig. 2g).DARS-AS1-ooruitdrukking het selgroei (1.8-voudig), ongeankerde sferoïedvorming (1.4-voudig) en kolonievorming (3.3-voudig) in SW620-selle aansienlik verhoog (Fig. 2d-f).Ons het hierdie resultaat bevestig deur 'n ander DARS-AS1-uitdrukkingsellyn, A549, te gebruik.Hierdie verbeterde selproliferasie as gevolg van DARS-AS1-ooruitdrukking is verder waargeneem in A549-selle (Aanvullende Fig. 2h, i en Aanvullende Tabel 3).Saam saam toon hierdie wins- en verliesstudies dat DARS-AS1 kankerselproliferasie in vitro bevorder.
Om die onderliggende meganisme waardeur DARS-AS1 selproliferasie reguleer te verken, het ons 'n RNA-aftrek-analise uitgevoer om sy potensiële proteïenbindende vennote te identifiseer.RT-qPCR resultate het getoon dat ongeveer 86.2% van DARS-AS1 in die sitoplasma van SW620 selle geleë is (Aanvullende Fig. 3a).Die in vitro getranskribeerde gebiotinileerde DARS-AS1 of pseudoRNA is dan geïnkubeer met SW620 selliste gevolg deur SDS-PAGE skeiding.Daaropvolgende silwerkleuring het getoon dat 'n duidelike band (~38 kDa) aansienlik verryk is in DARS-AS1 trekmonsters, maar nie in dummy RNA of krale monsters nie (Fig. 3a).Hierdie band is geïdentifiseer as 'n PKR-aktiverende proteïen (PACT) deur massaspektrometrie (MS) en verder bevestig deur immunoblotting in SW620, HCT116 en HepG2 sellyne (Fig. 3a,b).Die verryking van DARS en verwante PACT-proteïene – PKR en TRBP – is ook ondersoek met behulp van RNA-analise deur Western blotting (WB).Die resultate het aangedui dat geen direkte interaksie tussen DARS-AS1 RNA en hierdie drie proteïene gevind is nie (Aanvullende Fig. 3b).Die spesifieke interaksie tussen DARS-AS1 en PACT is verder bevestig deur RNA immunopresipitasie (RIP) analise, wat getoon het dat DARS-AS1 aansienlik verryk is in anti-PACT teenliggaampies maar nie ander kontrole RNAs nie (Figuur 3c).Om te bepaal of DARS-AS1 direk met PACT in die afwesigheid van enige ander sellulêre komponente in wisselwerking is, is 'n in vitro biolaag interferometrie (BLI) toets uitgevoer met gebruik van gesuiwerde PACT.Biotien-gemerkte DARS-AS1 of dummy RNA is geïmmobiliseer op streptavidien (SA) biosensors en dan geïnkubeer in kinetiese buffer wat 1 μM PACT bevat.Veral PACT het sterk gebind aan DARS-AS1 (KD-waarde ~26.9 nM), maar nie om RNA na te boots nie (Figuur 3d).Gesamentlik toon hierdie resultate 'n direkte interaksie en hoë affiniteit tussen DARS-AS1 en PACT.
RNA-trekanalise het DARS-AS1 geïdentifiseer wat met PACT in SW620-selle in wisselwerking tree.Hierbo, silwer kleuring van verwante proteïene.Laer immunoblots is uitgevoer met anti-PACT teenliggaampies.b RNA aftrek-analise is uitgevoer in HCT116 (bo) en HepG2 (onder) selle.PACT-verryking is deur immunoblotting opgespoor.cRNA immunopresipitasie (RIP) toetse is uitgevoer in SW620 selle met behulp van die aangeduide teenliggaampies.d PACT bindingskurwes aan vollengte DARS-AS1 of kontrole RNA is verkry deur gebruik te maak van biolaag interferometrie (BLI).RNA is op 'n streptavidien biosensor geïmmobiliseer.1 μM PACT is gebruik om assosiasie te meet.e RNA-trektoets is uitgevoer met behulp van gebiotinileerde vollengte DARS-AS1 of afgekap (bo).Immunoblot wat PACT ontvang toon (onder).f Gesuiwerde gevlagde PACT is geïnkubeer met gebiotinileerde vollengte DARS-AS1 of afgekap (soos in e) vir in vitro RIP-toets.Die onttrek RNA is geverifieer deur RT-qPCR.g Die relatiewe affiniteit van verskillende RNA-fragmente vir PACT is verkry met behulp van biolaag interferometrie.Vir ontleding is 100 nM RNA en 1 μM RAST gebruik.h In vitro RIP-toetse is uitgevoer met behulp van gesuiwerde ongeskonde of afgeknotte gemerkte PACT.Die onttrek RNA is geverifieer deur RT-qPCR.i Groeitempo van SW620-selle wat DARS-AS1, PACT of albei ooruitdruk.j Ooruitdrukking van vollengte of afgeknotte DARS-AS1 in SW620-selle het verskillende effekte op selgroei gehad.k Apoptose is opgespoor deur immunoblotting met anti-PARP-teenliggaampies.l Knockout van DARS-AS1 induseer apoptose van SW620-selle soos getoon deur vloeisitometrie.Getoonde data is die gemiddelde ± standaardafwyking van drie eksperimente. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, deur tweekantige Student se t-toets. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, deur tweekantige Student se t-toets. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 deur tweekantige Student se t-toets. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 deur tweekantige Student se t-toets.
Ons het toe drie gebiotinileerde DARS-AS1 RNA-fragmente gegenereer deur in vitro-transkripsie om die DARS-AS1-streek te identifiseer wat benodig word vir PACT-assosiasie (Figuur 3e).Die RNA-analise resultate het getoon dat elke fragment in staat was om met PACT te reageer, maar die 3'-terminale streek (384-768 nukleotiede gemerk A3) het meer as 1-384 nukleotiede gemerk A1 getoon (Fig. 3e).Soortgelyke resultate is waargeneem in die in vitro RIP-toets met behulp van rekombinante PACT (Figuur 3f).In ooreenstemming met hierdie resultate, het eksperimente om geïmmobiliseerde RNA-fragmente aan PACT met behulp van BLI te bind, ook getoon dat PACT 'n hoër affiniteit vir A3 (384–768 nt) (KD-waarde van ongeveer 94.6 nM) het, terwyl byna geen skakels met ander areas is nie.(Fig. 3d).
Ons het ook die gepaardgaande bindende streke in PACT ondersoek.PACT bevat drie funksionele domeine, waarvan twee gekonserveerde dubbelstring-RNA-bindende domeine (dsRBD) is en 'n derde domein (aangewys D3) wat as 'n aktiveerder van proteïeninteraksies optree.Om die lncRNA-bindingskapasiteit van elke domein te ondersoek, het ons drie mutasies gemanipuleer wat elk van die drie domeine verwyder het en 'n in vitro RIP-toets uitgevoer.Ons resultate het getoon dat die verwydering van die derde domein (D3) van PACT sy interaksie met DARS-AS1 aansienlik verminder het (met 0.11-voudig in vergelyking met ongeskonde PACT) in vergelyking met die ander twee mutasies (Fig. 3h), dit is getoon dat die vrystelling van D3 in wisselwerking met DARS.-AC1.Saamgevat dui hierdie resultate daarop dat interaksie tussen DARS-AS1 en PACT hoofsaaklik deur die 3'-kant van DARS-AS1 en die D3-domein van PACT kan plaasvind.
Ons het opgemerk dat DARS-AS1 geen effek op PACT uitdrukking gehad het nie en PACT geen effek op DARS-AS1 gehad het nie (Aanvullende Fig. 3c).Ons het toe die effek van PACT-afsakking op selgroei ondersoek.In teenstelling met DARS-AS1, het relatiewe selle 1,5-3 keer vinniger gegroei toe PACT platgeslaan is (Aanvullende Fig. 3d).Die resultate van die kolonievormingstoets het aangedui dat die selle 2-3-voudige kolonies gevorm het na shRNA-behandeling met PACT (Aanvullende Fig. 3e).Om te toets of DARS-AS1 selproliferasie deur PACT reguleer, het ons SW620-selle gegenereer wat PACT, DARS-AS1 of albei ooruitdruk.Ooruitdrukking van PACT het beduidende inhibisie van selproliferasie getoon (Figuur 3i).Terwyl DARS-AS1-ooruitdrukking per se selproliferasie aansienlik bevorder het, was daar geen beduidende verskil in die groeitempo van selle wat DARS-AS1 en PACT ooruitdruk nie.Hierdie resultate dui daarop dat PACT die verhoogde proliferasie wat veroorsaak word deur DARS-AS1-ooruitdrukking kan teëwerk.
Aangesien verskillende streke van DARS-AS1 verskillende PACT-bindende vermoëns het, het ons hul relatiewe invloed op selproliferasie deur verskillende ooruitdrukking van DARS-AS1-fragmente ondersoek.In vergelyking met die ander twee fragmente, is DARS-AS1 ooruitgedruk aan die 3'-einde (384-768 nt), die hoof-PACT-verwante streek in DARS-AS1, wat die hoogste vermoë gehad het om selproliferasie te stimuleer (Fig. 3j).Hierdie resultate dui op 'n positiewe korrelasie tussen die bindingskapasiteit en biologiese funksie van DARS-AS1.
Daar is gerapporteer dat PACT 'n pro-apoptotiese proteïen is19.Daarom het ons die effek van DARS-AS1 op apoptose ondersoek.Soos verwag, het DARS-AS1-afslaan die PARP-splyting in SW620-selle aansienlik verhoog en die proporsie van anneksien V-positiewe selle in SW620, HCT116, HepG2 en MBA-MD-231 sellyne verhoog (Fig. 3k).3).3f–h), wat aandui dat die anti-apoptotiese effek van DARS-AS1 in kankerselle teenoor die apoptose-induserende funksie van PACT is.Saamgevat dui hierdie resultate daarop dat die meganisme van DARS-AS1 onkogene funksie deur inhibisie van PACT funksie kan wees.
Vervolgens het ons die funksionele implikasies van die DARS-AS1-PACT-assosiasie ondersoek.Daar is gerapporteer dat PACT PKR aktiveer deur direkte interaksie, wat daarna eIF2α-fosforilering verhoog, wat translasie-uitwissing en apoptose veroorsaak17.Eerstens het ons ondersoek of DARS-AS1 die sellulêre lokalisering van PACT en PKR beïnvloed.Konfokale fluoressensiemikroskopie het getoon dat PACT en PKR hoogs gekolokaliseer is in SW620-selle met 'n gemiddelde Pearson-korrelasiekoëffisiënt van 0.72.Intussen het DARS-AS1-ooruitdrukking PACT- en PKR-ko-lokalisering aansienlik verminder (gemiddelde Pearson-korrelasiekoëffisiënt 0.61) (Figuur 4a).Om te ondersoek of DARS-AS1 die PACT-PKR interaksie kon moduleer, het ons 'n ko-immunopresipitasie (co-IP) toets uitgevoer met anti-PACT teenliggaampies in SW620 sellisate.PKR was hoogs verryk in anti-PACT in kontroleselle, terwyl PKR herstel aansienlik verminder is in lysate van selle wat DARS-AS1 ooruitdruk (Fig. 4b).Gesuiwerde gemerkte PACT en PKR is gebruik vir in vitro proteïenbindingstoetse.Gevolglik het diegene wat DARS-AS1 verskaf het, maar geen kontrole RNA, onderdrukte PACT-PKR interaksie getoon (Figuur 4c).Alle resultate het getoon dat DARS-AS1 PACT en PKR kommunikasie ontwrig het.
'n Ko-lokalisering van PACT en PKR in kontroleselle of selle wat DARS-AS1 ooruitdruk, is waargeneem deur gebruik te maak van konfokale fluoressensiemikroskopie.Die kerne is met DAPI gekleur.Statistiese resultate is van 16 foto's verkry.b Ko-immunopresipitasie (ko-IP) deur gebruik te maak van anti-PACT teenliggaampies in sellise van kontrole SW620 selle of selle wat DARS-AS1 ooruitdruk.c Gemerkte PACT, gesuiwerde PKR en in vitro getranskribeer met DARS-AS1 of skyn-RNA is geïnkubeer vir in vitro proteïenbindingsanalise.Anti-vlag teenliggaampies is gebruik vir immunopresipitasie.d Immunoblots met die aangeduide teenliggaampies is uitgevoer in SW620 en HCT116 selle wat getransfekteer is met kontrole shRNA of DARS-AS1-shRNA gevolg deur serum hongersnood.e DARS-AS1 uitdrukkingsvlakke het sellulêre sensitiwiteit vir thapsigargin verander.SW620 selle is getransfekteer met DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 ooruitdrukking plasmied of kontrole plasmied.Selle is vir 48 uur met thapsigargin behandel en sellewensvatbaarheid is bepaal deur die MTS-reagens te gebruik.f In vitro getranskribeerde DARS-AS1 of dummy RNA en gesuiwerde PACT is gebruik vir in vitro aktivering toets en immunoblot opsporing.g Immunoblots wat hierdie teenliggaampies gebruik, is uitgevoer op SW620-ctrl-selle (links) of selle wat PKR-mutante ooruitdruk (regs).Hierdie selle is dan getransfekteer met kontrole shRNA of DARS-AS1-shRNA gevolg deur serum hongersnood.h Vloeisitometrie het getoon dat inaktivering van die mutante PKR vergoed het vir DARS-AS1-geïnduseerde apoptose in SW620-selle.i Immunoblots met die aangeduide teenliggaampies is in SW620 (links) of HCT116 (regs) selle uitgevoer.Selle wat met kontrole shRNA of DARS-AS1 shRNA getransfekteer is, word serum ontneem en aangevul met 100 nM PKR C16 inhibeerder of DMSO.Skaalstaaf = 5 µm.Getoonde data is die gemiddelde ± standaardafwyking van drie eksperimente.* p ≤ 0.05 tweestert Student se t-toets.
Daar word algemeen geglo dat sodra PACT met PKR17 in wisselwerking tree, PKR-fosforilering by Thr451 geïnduseer kan word.Ons resultate het aangedui dat die vlak van PKR-fosforilering aansienlik verhoog is in DARS-AS1-afbreekselle na serumhonger (Fig. 4d en Aanvullende Fig. 4a).Gevolglik het ons gevind dat fosforilering van eIF2α, die hoof PKR substraat, ook aansienlik verhoog is deur DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d en Aanvullende Fig. 4a).Thapsigargin is 'n ER stressor wat veroorsaak dat die ER Ca2+ vrystel.Behandeling met thapsigargin is gerapporteer om die uitdrukking en aktivering van PACT te induseer, wat verder interaksie met en aktiveer PKR, wat lei tot apoptose deur die verhoging van eIF2α fosforilering 18,61.Hier het ons thapsigargin as 'n stimulator van die PACT/PKR-weg gebruik om te ondersoek of DARS-AS1 selle kan help om stres te oorkom deur die PACT/PKR-weg te inhibeer.Ons het waargeneem dat die vlak van DARS-AS1 uitdrukking positief gekorreleer het met selweerstand teen thapsigargin.SW620-selle wat DARS-AS1 ooruitdruk, het beter oorleef wanneer dit met thapsigargin behandel is, terwyl selle met DARS-AS1-afslag meer vatbaar geword het (Fig. 4e).In ooreenstemming met hierdie resultate het DARS-AS1-ooruitdrukking thapsigargin-geïnduseerde PKR-fosforilering verminder (Aanvullende Fig. 4b).Daarenteen, na thapsigargin-behandeling, is PKR en eIF2α tot 'n hoër mate gefosforileer in DARS-AS1 afslaanselle in vergelyking met kontroleselle (Aanvullende Fig. 4b).Interessant genoeg het thapsigargin DARS-AS1-uitdrukking op 'n dosisafhanklike wyse geïnduseer, wat 'n anti-stresfunksie van DARS-AS1 kan aandui (Aanvullende Fig. 4c).Daarbenewens het ons in vitro aktiveringstoetse uitgevoer om hierdie waarnemings te bevestig.Kortliks, PKR is gesuiwer van sellisate deur gebruik te maak van 'n anti-PKR teenliggaam, dan geïnkubeer met rekombinante PACT en DARS-AS1 wat in vitro getranskribeer is.Na die ensiematiese reaksie is fosfo-PKR met behulp van WB opgespoor.Ons resultate het aangedui dat PKR-fosforilering aansienlik deur DARS-AS1 geïnhibeer is, maar nie deur kontrole-RNA nie (Figuur 4f).Hierdie in vitro en in vivo resultate dui daarop dat DARS-AS1 PACT-gemedieerde PKR-aktivering inhibeer.Terselfdertyd het ons ook 'n afname in PACT-herstel in die teenwoordigheid van DARS-AS1 waargeneem (Figuur 4f).Hierdie resultaat stem ooreen met die resultate van die in vitro proteïenbindingstoets (Figuur 4c) en illustreer weer die blokkeerfunksie van DARS-AS1 vir PACT-PKR assosiasie.
Ser246 en Ser287 in die D3-domein van PACT word benodig vir PKR-aktivering onder sellulêre stres.Vervanging van twee serienreste vir alanien het mutant PACT (mutD) gegee, wat PKR geaktiveer het in die afwesigheid van stres, en vervanging vir alanien (mutA) het die protokol omgekeer.Aangesien ons die belangrikheid van hierdie domein in direkte assosiasie met DARS-AS1 gedemonstreer het, het ons hierdie twee PACT-mutante gegenereer om te toets of hierdie residue ook by interaksie met DARS-AS1 betrokke kan wees.Interessant genoeg het beide mutante die vermoë verloor om aan DARS-AS1 te bind (Aanvullende Fig. 4d), wat daarop dui dat die volledige struktuur van die PACT-proteïen nodig mag wees vir doeltreffende interaksie met DARS-AS1.
Verder stel ons resultate ook voor dat DARS-AS1-shRNA-geïnduseerde inhibisie van selproliferasie gedeeltelik herstel kan word deur 'n dominante negatiewe PACT-mutant (PACTmutA) of 'n dominante negatiewe PKR-mutant (PKRmut) (Aanvullende Fig. 4e. e) te oordruk.Ooruitdrukking van dominant-negatiewe PKR-mutante het PKR-fosforilering verminder wat deur DARS-AS1-afslag sowel as eIF2α-fosforilering in serum-ontneemde selle veroorsaak is (Fig. 4g).Belangriker nog, die proporsie apoptotiese selle wat deur DARS-AS1-afslag veroorsaak is, is ook verminder in selle wat PKRmut ooruitdruk (Fig. 4h en Aanvullende Fig. 4g).Inhibisie van PKR-kinase-aktiwiteit benadeel ook DARS-AS1-funksie, aangesien resultate getoon het dat DARS-AS1-afval selde PKR- en eIF2α-fosforilering veroorsaak het wanneer selle met 'n PKR-spesifieke C16-inhibeerder behandel is (Fig. 4i en Aanvullende Fig. 4h).).Saamgevat dui ons resultate daarop dat DARS-AS1 selproliferasie bevorder, ten minste gedeeltelik, deur PACT-gemedieerde PKR-aktivering te inhibeer.
Om die rol van DARS-AS1 in tumorgenese verder te verken, het ons in vivo eksperimente uitgevoer met behulp van 'n muis xenograft model. Resultate toon dat afbreek van DARS-AS1 tumorgroei in muise dramaties verminder het (p-waarde < 0,0001) (Fig. 5a). Resultate toon dat afbreek van DARS-AS1 tumorgroei in muise dramaties verminder het (p-waarde < 0,0001) (Fig. 5a). Resolusie is beskikbaar, maar DARS-AS1 is tans beskikbaar vir my (gesonde p <0,0001) (5 jaar). Die resultate toon dat DARS-AS1-afval tumorgroei in muise drasties verminder (p-waarde < 0,0001) (Figuur 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（囀5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a） Resolusies beskikbaar, met die DARS-AS1, het 'n goeie kans om te gebruik (ongeveer <0,0001) (5). Die resultate het getoon dat DARS-AS1-afval tumorgroei in muise aansienlik verminder het (p-waarde < 0,0001) (Figuur 5a).Dus, in die DARS-AS1 afslaangroep was daar 'n beduidende afname in gemiddelde tumorvolume met ongeveer 72.9% en gemiddelde tumormassa met ongeveer 87.8% (Figuur 5b-d).Hierdie resultate dui sterk daarop dat DARS-AS1 tumorgroei in vivo aansienlik kan bevorder.
Effekte van ad DARS-AS1 knockdown op kolorektale onkogenese in naakmuise.Groeikrommes (a), tumorgrootte (b), gewig (c) en tumorbeelde (d) word getoon.Foutstawe verteenwoordig ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, deur tweekantige Student se t-toets. n = 10. ****p < 0,0001, deur tweekantige Student se t-toets. n = 10. ****p < 0,0001 vir двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 tweestert Student se t-toets.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 vir двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 tweestert Student se t-toets.e Kaplan-Meier het die korrelasie tussen DARS-AS1 uitdrukkingsvlakke en algehele oorlewing in pasiënte met UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM en LGG ontleed.Hoë vlakke van DARS-AS1 uitdrukking in pasiënte was in die top 50%;die lae vlak van DARS-AS1 uitdrukking in pasiënte was in die onderste 50%.p-waardes is bepaal met behulp van die log-rangtoets.f Voorgestelde model waarin DARS-AS1 die PACT-PKR pad en tumorgroei reguleer.
Om die kliniese impak van DARS-AS1 beter te verstaan, het ons die korrelasie tussen die uitdrukking daarvan en pasiëntoorlewing ondersoek.Deur die TCGA-datastel te ontleed, het ons gevind dat hoër DARS-AS1-uitdrukking geassosieer word met uveale melanoom (UVM), renale chromofobie (KICH), nierpapillêre selkarsinoom (KIRP), mesothelioom (MESO), multipleks.Laer oorlewing was beduidend geassosieer met glioblastoommorfose (GBM) en pasiënte met laegraadse breinglioom (LGG) (Figuur 5e).Hierdie resultate dui daarop dat DARS-AS1 'n belangrike rol in kliniese tumorprogressie kan speel en 'n potensiële voorspellende biomerker in veelvuldige kankers kan wees.
In hierdie studie, deur gebruik te maak van grootskaalse CRISPRI-funksionele sifting, het ons vasgestel dat DARS-AS1 lncRNA kankerselstres oorkom deur twee sleutelstresresponsers, PACT en PKR, te reguleer.Deur direk met PACT in wisselwerking te tree, het DARS-AS1 PACT-gemedieerde PKR-aktivering geïnhibeer, en sodoende apoptotiese seldood voorkom en selproliferasie bevorder (Fig. 5f).Opregulering van DARS-AS1 is waargeneem in veelvuldige tipes kanker, wat daarop dui dat die funksie daarvan om kankerseloorlewing onder stresvolle toestande te bevorder breedweg van toepassing kan wees op veelvuldige tipes kanker.
PACT is geïdentifiseer as 'n PKR-aktiveerderproteïen, en PACT-gemedieerde PKR-aktivering speel 'n belangrike rol in stresreaksies deur transkripsie, translasie, apoptose en ander belangrike sellulêre prosesse te reguleer62.Vir dekades is pogings aangewend om die kankerspesifieke regulering van die PACT-PKR-kaskade te verstaan.Hier het ons studie 'n ander meganisme van regulering van PACT-PKR in kankerselle aan die lig gebring deur sellulêre lncRNA DARS-AS1, wat direk aan PACT bind, PACT-PKR-interaksie blokkeer, PKR-aktivering en eIF2α-fosforilering inhibeer, en sodoende stresgeïnduseerde apoptose inhibeer en uiteindelike kankerproliferasie te stimuleer.selle.Hierdie ontdekking werp lig op potensiële lncRNA-teikens vir kankerprognose en -terapie.
Ons data het getoon dat DARS-AS1 knockdown selle sensitiseer vir serumhongersnood met 'n beduidende toename in gefosforileerde PKR en eIF2α.Hierdie resultate dui daarop dat DARS-AS1 kankerseloorlewing onder moeilike toestande bevorder deur PACT/PKR-aktiwiteit te inhibeer.Verskeie ander nie-koderende RNA's, soos ASPACT en nc886, is ook betrokke by die PACT/PKR-as deur PACT48 mRNA af te reguleer of outofosforilering te reguleer deur aan PKR49,50,64 te bind.Onder hulle tree DARS-AS1 op as 'n ontwrigter van die PACT-PKR-vereniging.Hierdie studie verryk ons ​​begrip van PACT/PKR-asregulering en die rol van lncRNAs in stresreaksies.
PACT bevat drie afsonderlike domeine.Elk van die eerste twee dsRBD's is voldoende om hoë affiniteitsbinding van PACT aan PKR te bereik, terwyl die derde domein (D3) benodig word vir PKR-aktivering in vitro en in vivo.Ons studie het getoon dat DARS-AS1 verkieslik met die D3-domein interaksie het (Fig. 3h).Gegewe die groot grootte van die lncRNA (768 nukleotiede), kan DARS-AS1-binding aan D3 die interaksie tussen die PACT-domein van dsRBD en PKR fisies inhibeer, en sodoende die assosiasie van PACT en PKR blokkeer.PACT-puntmutasies wat Ser246 en Ser287 in D3 met alanien of aspartaat vervang het, het sy bindingsaffiniteit vir DARS-AS1 ontwrig, wat dui op die belangrikheid van D3 se algehele strukturele en elektriese eienskappe in hul assosiasie.Verdere besonderhede van hierdie meganisme sal in die toekoms vereis word, met meer akkurate biochemiese analise en hoë resolusie PACT strukturele analise.
Vorige studies het gerapporteer dat DARS-AS1 selproliferasie bevorder deur verskeie meganismes51,52,53.In een voorbeeld het ondersoekers opgemerk dat DARS-AS1 sy antisense-proteïenkoderende DARS-geen opgereguleer het deur miP-194-5p in nierkankerselle te teiken.In die huidige studie het DARS-AS1-afslag egter min effek gehad op DARS-transkripsie in verskeie tipes kanker, insluitend ten minste kolorektale, bors- en lewerkanker.Omdat lncRNA's sel- en weefselspesifieke uitdrukkingspatrone vertoon, kan funksionele meganismes nie oor kankertipes bewaar word nie, wat kan bydra tot hierdie verskil tussen ons waarnemings en vorige assesserings van verskillende kankers.Spesiale studies is nodig om die spesifieke meganismes van verskeie fisiologiese en patologiese prosesse toe te lig.
'n Ontleding van kliniese data het getoon dat DARS-AS1 uitdrukking in gewasse omgekeerd gekorreleer is met die oorlewing van kankerpasiënte, wat die belangrikheid van die DARS-AS1/PACT/PKR-as in kankerprognose onderstreep.Ten slotte, ons studie toon dat DARS-AS1 'n reguleerder van die PACT/PKR sein-as is, kankerselproliferasie bevorder en apoptose inhibeer tydens die stresreaksie, wat 'n ander lyn van navorsing verskaf en van belang is vir toekomstige navorsing oor potensiële behandelings .
Menslike sellyne SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 en HEK293T is verkry vanaf die Nasionale Sellynhulpbroninfrastruktuur in China.Alle selle is onderhou in DMEM-medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) aangevul met 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) en 1% penisillien-streptomisien (Thermo Fisher Scientific) by 37°C, 5% CO2.broeikas.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Anti-Vlag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (fosfor S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfor S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulien, CST (2128);normale muis IgG, CST (5415S);normale konyn IgG, CST (2729S).Teenliggaampies is 1:1000 verdun in PBST vir Western blotting en 1:100 vir IP.
sgRNA's is ontwikkel met behulp van 'n publiek beskikbare instrument genaamd CRISPR-ERA66.Ons het die standaard gereedskapparameters vir sgRNA-ontwikkeling gebruik en die algoritme berekende sgRNA-bindingsplekke in die 3 kb-streek.gesentreer by TSS.Poele van sgRNA oligonukleotiede is gesintetiseer by CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) en gekloneer in gehumaniseerde pgRNA plasmiede (Addgene #44248).'n Totaal van 12 µg saamgevoegde gehumaniseerde pgRNA-plasmied, 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260), en 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) is mede-transfekteer in 5 x 106 HEK293T deur gebruik te maak van DNA 10-transeksie-skottels selle (CWBIO, Beijing, China) volgens die vervaardiger se instruksies.Virusbevattende supernatante is 48 en 72 uur na transfeksie versamel en deur 'n 0.45 µm filter gefiltreer.Vir sifting is SW620-selle wat die dCas9/KRAB-fusieproteïen uitdruk deur virustransduksie verkry.Gemodifiseerde SW620-selle is geïnfekteer met die virusbiblioteek in vier onafhanklike infeksie-eksperimente teen 'n MOI van 0.1-0.3 en is vir 2 dae met 2 μg/ml puromisien (Sigma, St. Louis, MO) gemonster.Daarna is selle vir 18 dae in vitro gekweek met 'n minimum biblioteekdekking van 500 selle/sgRNA vir sifting.
Genomiese DNA is onttrek volgens die instruksies van die QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Duitsland; 51183).In totaal is 100 μg genomiese DNA per biologiese herhaling gebruik om die biblioteek te bou.Die sgRNA-streek is deur twee rondtes PCR versterk en aan 'n strepieskode gekoppel.
PCR-produkte is gesuiwer met behulp van NucleoSpin®-gel en PCR-suiweringstel (MACHEREY-NAGEL, Düren, Duitsland; 740609.250) en gekwantifiseer deur gebruik te maak van Qubit™ HS dubbelstring-DNS-opsporingstel (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Die MTS-toets is gebruik om selproliferasie te meet.Selle is gesaai in 96-put plate teen 'n aanvanklike digtheid van 2000 selle/put.Die relatiewe aantal selle is daagliks gemeet op die aangeduide tyd vir 'n totaal van 4-6 dae.Vir elke put is 20 μl MTS-reagens (Promega) verdun met 100 μl DMEM, geïnkubeer met selle vir 4 uur by 37°C, en dan is OD490 gemeet.
Die kapasiteit vir ongeankerde groei is ontdek deur die vorming van sfere te ontleed.Kortliks, 2000 selle getransfekteer met shRNA DARS-AS1 of kontrole shRNA is gekweek in ultra lae aanhegting mikroplate (Corning) met medium verandering elke 4 dae.Die sferoïede is na 14 dae getel.500 selle getransfekteer met die DARS-AS1 ooruitdrukking plasmied of 'n kontrole plasmied is gebruik vir die verbetering toets, anders was die metode onveranderd.
RNA is getranskribeer met behulp van T7 RNA polimerase en biotien-16-UTP (Roche 1138908910) volgens die instruksies van Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Die primers wat hier gebruik word, word in aanvullende tabel 4 gelys.
Proteïenkoderende PACT- of PKR-streke is in pET15b (Addgene #73619) gekloneer en in BL21(DE3) getransformeer.Die bakterieë is oornag geïnkubeer in LB wat met ampicillien voorsien is en dan 100-voudig verdun met vars LB.Wanneer die OD600 van die medium 0.8 bereik het, is 1 mM IPTG bygevoeg om proteïen uitdrukking te induseer.Na inkubasie oornag met sagte skud (250 rpm by 20°C), is die selkorrel deur sentrifugering (4000 rpm, 10 min, 4°C) versamel.Hersuspendeer die selkorrel in lysisbuffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) en inkubeer op ys vir 30 min, sonikeer dan (15 min, 5 s aan/af, op ys) en sentrifugeer (13 000) rpm)., 30 min, 4°С).Die supernatant is dan op Ni-NTA-hars (QIAGEN) 3 keer by 4°C gelaai, 4 keer gewas met wasbuffer (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidasool, 250 mM NaCl) en 3 keer geëlueer, met 'n totaal van 10 ml eluentbuffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidasool).Gesuiwerde proteïen is met behulp van WB bepaal en die konsentrasie is bepaal met behulp van die Qubit™ proteïentoetsstel (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP-toetse is uitgevoer soos voorheen beskryf, met wysigings.Kortliks, 1x RIP-buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin-ribonuklease-inhibeerder (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) liseer sitostatiese 1 x 107 skemerkelkie (Roche, 1 mM DTT) en sentrifugeer teen 13 000 rpm vir 15 min by 4 °C.Die supernatant is dan geïnkubeer met proteïen A+G magnetiese krale (Millipore) gekonjugeer met 5 μg anti-PACT teenliggaampie (Abeam) of IgG (CST).Die krale is 5 keer gewas met 5x RIP buffer, dan verteer met proteïenase K (NEB).RNA is met Trizol onttrek en deur RT-qPCR bepaal.Primers word in Aanvullende Tabel 5 aangebied.
Die in vitro RIP-toets is uitgevoer volgens 'n gewysigde standaard RIP-toetsprotokol.'n Totaal van 5 pmol van in vitro getranskribeerde RNA is 1x verdun met RIP buffer en uitgegloei deur inkubasie by 65°C vir 5 minute gevolg deur stadige afkoeling tot kamertemperatuur.'n Totaal van 5 pmol ongeskonde of gemuteerde vlag-gemerkte PACT proteïene is gesuiwer vanaf E. coli.Inkubeer met gerenatureerde RNA vir 2 uur by 4°C en volg die bogenoemde prosedure vir RIP-analise vir anti-vlag IP.
Vir RNA-uitbreidingsanalise is 1×107 selle gelys met 1xRIP buffer.Na sentrifugering by 13 000 rpm vir 15 min by 4°C, is die supernatant vooraf behandel met 30 μl streptavidien magnetiese krale (Beckman) vir 2 uur by 4°C.Die gesuiwerde lysaat is toe van gis-tRNA voorsien en oornag by 4°C met 40 pmol gerenatureerde RNA geïnkubeer, daarna vir nog 2 uur en 20 μl nuwe streptavidien magnetiese krale wat met BSA geblokkeer is, is bygevoeg.Die wasstap het bestaan ​​uit 4 keer met 5x RIP buffer en 4 keer met 1x RIP buffer.Die ooreenstemmende proteïene is geëlueer met biotien-elutiebuffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotien, PMSF) en geskei op NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Na silwerkleuring (Beyotime Biotegnologie), is sekere bande uitgesny en deur MS ontleed.
Co-IP analise is uitgevoer om die interaksie tussen PACT en PKR te toets.Kortliks, supernatant-lisate is voorberei deur 1 x 107 gelyseerde selle in 1 x RIP-buffer te inkubeer, gevolg deur sentrifugering by 13 000 rpm vir 15 minute by 4°C.Lysate is gelaai met proteïen A + G magnetiese krale, gekonjugeer met 5 µg anti-PACT teenliggaam, en saggies oornag geroteer by 4°C.Die krale is 3 keer gewas met 5×RIP buffer, twee keer met 1×RIP buffer en geëlueer met 1×SDS buffer.Die herwonne proteïen is deur SDS-PAGE-jel ontleed en deur WB opgespoor.
Twee pmol gevlagde PACT en 1 pmol PKR is van E. coli gesuiwer.Verdun in 1 x RIP-buffer en inkubeer met 10 pmol gerenatureerde RNA vir 2 uur by 4 °C.Daarna is hulle geïnkubeer met proteïen A+G magnetiese kraal-gekonjugeerde anti-gemerkte teenliggaampie vir 'n bykomende twee uur.Die krale is dan vier keer gewas met 1x RIP buffer en geëlueer met 1x SDS buffer.Die gevolglike PACT en PKR is deur WB opgespoor.