Dankie dat jy Nature.com besoek het.Die blaaierweergawe wat jy gebruik het beperkte CSS-ondersteuning.Vir die beste ervaring, beveel ons aan dat jy 'n opgedateerde blaaier gebruik (of versoenbaarheidsmodus in Internet Explorer deaktiveer).In die tussentyd, om volgehoue ondersteuning te verseker, sal ons die webwerf sonder style en JavaScript weergee.
Ensiematiese nabyheidsetiketteringsmetodes gebaseer op geaktiveerde esters of fenoksi-radikale word wyd gebruik om subsellulêre proteome en proteïeninteraktors in lewende selle te karteer.Geaktiveerde esters is egter minder reaktief, wat 'n wye etiketteringsradius tot gevolg het, en fenoksieradikale wat deur peroksiedbehandeling gegenereer word, kan inmeng met redoksweë.Hier rapporteer ons 'n nabyheidsetiketteringsafhanklike fotoaktivering (PDPL) metode wat ontwikkel is deur die miniSOG-fotosensitiseerder-proteïen geneties aan 'n proteïen van belang te koppel.Geaktiveer deur blou lig en beheer deur blootstelling tyd, singlet suurstof word gegenereer en dan tydruimtelik opgelos etikettering van histidien residue deur die anilien sonde bereik.Ons demonstreer die hoë getrouheid daarvan deur organelspesifieke proteoomkartering.'n Sy-aan-sy vergelyking van PDPL met TurboID toon 'n meer spesifieke en omvattende proteomiese dekking van PDPL.Vervolgens het ons PDPL toegepas op die siekte-geassosieerde transkripsionele koaktivator BRD4 en E3 Parkin ligase en voorheen onbekende interaktors gevind.Deur ooruitdrukking sifting, is twee onbekende substrate, Ssu72 en SNW1, vir Parkin geïdentifiseer, wie se afbraak bemiddel word deur die ubiquitination-proteasoom pad.
Akkurate karakterisering van proteïennetwerke lê onder baie fundamentele sellulêre prosesse.Daarom sal hoogs akkurate tydruimtelike kartering van proteïeninteraksies 'n molekulêre basis bied vir die ontsyfering van biologiese weë, siektepatologie en die ontwrigting van hierdie interaksies vir terapeutiese doeleindes.Vir hierdie doel is metodes wat in staat is om tydelike interaksies in lewende selle of weefsels op te spoor hoogs wenslik.Affiniteitssuiweringsmassaspektrometrie (AP-MS) is histories gebruik om bindingsvennote van proteïene van belang (POI's) te identifiseer.Met die ontwikkeling van kwantitatiewe proteomika-metodes is Bioplex3.0 geskep, die grootste databasis van proteïennetwerke gebaseer op AP-MS.Alhoewel AP-MS baie kragtig is, is die sellise en verdunningstappe in die werkvloei bevooroordeeld na swak en verbygaande bindingsinteraksies en stel post-lise artefakte in soos valse interaksiepare wat nie kompartementalisering voor lise het nie.
Om hierdie kwessies aan te spreek, is onnatuurlike aminosure (UAA) met kruisbindingsgroepe en ensiematiese nabygeleë etikettering (PL) platforms (bv. APEX en BioID)5 ontwikkel.Alhoewel die UAA-metode suksesvol in baie scenario's toegepas is en inligting verskaf oor direkte proteïen-kleefmiddels, is optimalisering van die UAA-invoegplek steeds nodig.Belangriker nog, dit is 'n stoïgiometriese etiketteringmetode wat nie 'n katalitiese omkering van etiketteringgebeure het nie.Daarteenoor smelt ensiematiese PL-metodes, soos die BioID-metode, die gemanipuleerde biotienligase saam met POI7, wat biotien vervolgens aktiveer om 'n reaktiewe biotiniel-AMP-ester-tussenproduk te vorm.Die ensiem kataliseer en stel dus 'n geaktiveerde biotien "wolk" vry wat proksimale lisienreste merk.BioID benodig egter meer as 12 uur om 'n voldoende gemerkte sein te verkry, wat die gebruik daarvan met tydelike resolusie uitsluit.Deur gebruik te maak van gerigte evolusie gebaseer op gis vertoon, is TurboID ontwerp gebaseer op BioID om meer doeltreffend te wees, wat doeltreffende etikettering met biotien binne 10 minute moontlik maak, sodat meer dinamiese prosesse bestudeer kan word.Omdat TurboID hoogs aktief is en endogene biotienvlakke voldoende is vir laevlak-etikettering, word agtergrondetikettering 'n potensiële probleem wanneer hoogs verbeterde en tydige etikettering vereis word deur die byvoeging van eksogene biotien.Daarbenewens is geaktiveerde esters swak reaktief (t1/2 ~5 min), wat kan lei tot 'n groot etiketteringsradius, veral na versadiging van naburige proteïene met biotien 5. In 'n ander benadering, genetiese samesmelting van gemanipuleerde askorbaatperoksidase (dws biotien- fenol radikale en laat proteïenetikettering binne een minuut toe9,10.APEX word wyd gebruik om subsellulêre proteome, membraanproteïenkomplekse en sitosoliese seinproteïenkomplekse te identifiseer11,12.Die behoefte aan hoë konsentrasies peroksiede kan egter redoksproteïene of weë beïnvloed, sellulêre prosesse.
Dus, 'n nuwe metode wat in staat is om meer reaktiewe gemerkte-radius-onderdrukkingspesies met hoë ruimtelike en tydelike akkuraatheid te genereer sonder om sellulêre weë aansienlik te ontwrig, sal 'n belangrike toevoeging tot bestaande metodes wees. Onder die reaktiewe spesies het enkelsuurstof ons aandag getrek as gevolg van sy kort leeftyd en beperkte diffusie radius (t1/2 < 0.6 µs in selle)13. Onder die reaktiewe spesies het enkelsuurstof ons aandag getrek as gevolg van sy kort leeftyd en beperkte diffusie radius (t1/2 < 0.6 µs in selle)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Onder die aktiewe vorms het enkelsuurstof ons aandag getrek as gevolg van sy kort leeftyd en beperkte diffusie radius (t1/2 < 0.6 µs in selle)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs 伕〷sek. 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Onder aktiewe vorms trek enkelsuurstof ons aandag vanweë sy kort leeftyd en beperkte diffusieradius (t1/2 < 0.6 μs in selle).Daar is gerapporteer dat enkelsuurstof lukraak metionien, tirosien, histidien en triptofaan oksideer, wat dit polêr 14,15 maak vir hegting aan amien- of tiolgebaseerde probes16,17.Alhoewel enkelsuurstof gebruik is om subsellulêre kompartement RNA te merk, bly strategieë vir die hergebruik van endogene POI nabyheidsmerkers onontgin.Hier bied ons 'n platform genaamd fotoaktivering-afhanklike nabyheidsetikettering (PDPL), waar ons blou lig gebruik om PVB's wat met 'n miniSOG-fotosensibiliseerder saamgesmelt is, te verlig en singlet-suurstofgenerering te aktiveer om proksimale residue te oksideer, gevolg deur amienbevattende modifikasies om chemiese probes te oksideer in intermediêre lewende selle..Ons het 'n groep chemiese probes getoets om merker-spesifisiteit te maksimeer en wysigingswerwe geïdentifiseer deur 'n oop proteomika-werkvloei te gebruik.'n Sy-aan-sy vergelyking van PDPL met TurboID toon 'n meer spesifieke en omvattende proteomiese dekking van PDPL.Ons het hierdie benadering toegepas op organelspesifieke merkers van die subsellulêre proteoom en algemene proteoomidentifikasie van bindingsvennote vir die kankergeassosieerde epigenetiese regulatoriese proteïen BRD4 en die Parkinson-siekte-geassosieerde E3-ligase Parkin, wat beide 'n bekende en 'n onbekende netwerk van proteïen bevestig het. interaksies..Die vermoë van PDPL om E3-substrate in groot proteïenkomplekse te herken verteenwoordig 'n situasie waar herkenning van indirekte binders vereis word.Twee onbekende parkin-substrate bemiddel deur ubiquitination-proteasome is in situ bevestig.
Fotodinamiese terapie (PDT)19 en chromofoor-ondersteunde laser-inaktivering (CALI)20, waarin ligbestraling met fotosensibiliseerders enkelsuurstof genereer, kan teikenproteïene inaktiveer of seldood veroorsaak.Aangesien singlet suurstof 'n hoogs reaktiewe stof met 'n teoretiese diffusieafstand van ongeveer 70 nm is, kan ruimtelik beperkte oksidasie rondom die fotosensibiliseerder beheer word.Op grond van hierdie konsep het ons besluit om enkelsuurstof te gebruik om noukeurige etikettering van proteïenkomplekse in lewende selle te verkry.Ons het 'n PDPL chemoproteomiese benadering ontwikkel om vier funksies te vervul: (1) om die generering van aktiewe singlet suurstof soortgelyk aan die PL ensiematiese benadering te kataliseer;(2) verskaf tyd-opgeloste etikettering by lig inisiëring;(3) deur verandering (4) Vermy die gebruik van endogene kofaktore (soos biotien) om agtergrond te verminder, of gebruik hoogs ontstellende eksogene reagense (soos peroksiede) om selblootstelling aan omgewingstres te minimaliseer.
Fotosensitiseerders kan in twee kategorieë verdeel word, insluitend klein molekulêre gewig fluorofore (bv. roosbengale, metileenblou)22 en geneties gekodeerde klein proteïene (bv. miniSOG, KillerRed)23.Om 'n modulêre ontwerp te bereik, het ons die eerste generasie PDPL-platform ontwikkel deur fotosensitiseerder (PS) proteïene by POI24,25 te voeg (Figuur 1a).Wanneer dit met blou lig bestraal word, oksideer enkelsuurstof proksimale nukleofiele aminosuurreste, wat lei tot 'n ompolingpolariteit wat elektrofiel is en verder met amiensonde-nukleofiele kan reageer16,17.Die sonde is ontwerp met 'n alkynhandvatsel om klikchemie toe te laat en af te trek vir LC/MS/MS-karakterisering.
Skematiese illustrasie van etikettering van proteïenkomplekse bemiddel deur miniSOG.Wanneer dit aan blou lig blootgestel word, genereer selle wat miniSOG-POI uitdruk singlet suurstof, wat interaksie proteïene verander, maar nie nie-bindende proteïene nie.Tussenprodukte van fotooksidasie word onderskep deur aflosetikette van die amien chemiese sonde om kovalente addukte te vorm.Die alkynielgroep op die chemie-sonde laat klikchemie toe vir verryking deur aftrek, gevolg deur LC-MS/MS-kwantifisering.b Chemiese struktuur van amienprobes 1-4.c Verteenwoordigende fluoresserende gelanalise van mitochondriale gelokaliseerde miniSOG-gemedieerde proteomiese merkers deur gebruik te maak van probes 1-4 en relatiewe kwantifisering gebaseer op gel densitometrie.Die sein-tot-agtergrond verhouding van chemiese probes is geassesseer met behulp van negatiewe kontrole eksperimente wat blou lig uitsluit of deur HEK293T selle sonder miniSOG uitdrukking te gebruik.n = 2 biologies onafhanklike monsters.Elke kolletjie verteenwoordig 'n biologiese replika.d Verteenwoordigende opsporing en kwantifisering van PDPL deur gebruik te maak van geoptimaliseerde sonde 3 in die teenwoordigheid of afwesigheid van die aangeduide PDPL komponente soos c.n = 3 biologies onafhanklike monsters.Elke kolletjie verteenwoordig 'n biologiese replika.Middellyne en snorbaarde verteenwoordig die gemiddelde en ± standaardafwyking.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Konfokale beelding van enkelsuurstof met verrooi Si-DMA-vlek.Skaalbalk: 10 µm.Gelbeelding en konfokale eksperimente is ten minste twee keer onafhanklik herhaal met soortgelyke resultate.
Ons het eers die vermoë van die volwasse fotosensibiliseerders miniSOG26 en KillerRed23, stabiel uitgedruk in HEK293T, getoets om propargylamien-etikettering van die proteoom as 'n chemiese sonde te bemiddel (Aanvullende Fig. 1a).Gel-fluoressensie-analise het getoon dat die hele proteoom-etikettering verkry is deur gebruik te maak van miniSOG en blou lig bestraling, terwyl geen sigbare etikettering produk met KillerRed waargeneem is nie.Om die sein-tot-agtergrond-verhouding te verbeter, het ons toe 'n stel chemiese probes getoets wat anilien (1 en 3), propylamien (2) of bensielamien (4) bevat.Ons het waargeneem dat HEK293T-selle self 'n hoër agtergrondsein het in vergelyking met geen blou lig nie, moontlik as gevolg van die endogene riboflavien-fotosensitiseerder, flavienmononukleotied (FMN) 27 . Anilien-gebaseerde chemiese probes 1 en 3 het beter spesifisiteit gegee, met HEK293T wat miniSOG in mitochondria stabiel uitdruk wat 'n >8-voudige toename in sein vir probe 3 vertoon, terwyl probe 2 wat gebruik word in die RNA-etiketteringsmetode CAP-seq slegs ~2.5- vertoon vou seinverhoging, waarskynlik as gevolg van verskillende reaktiwiteitsvoorkeure tussen RNA en proteïen (Fig. 1b, c). Anilien-gebaseerde chemiese probes 1 en 3 het beter spesifisiteit gegee, met HEK293T wat miniSOG in mitochondria stabiel uitdruk wat 'n >8-voudige toename in sein vir probe 3 vertoon, terwyl probe 2 wat gebruik word in die RNA-etiketteringsmetode CAP-seq slegs ~2.5- vertoon vou seinverhoging, waarskynlik as gevolg van verskillende reaktiwiteitsvoorkeure tussen RNA en proteïen (Fig. 1b, c).Anilien-gebaseerde chemiese probes 1 en 3 het beter spesifisiteit getoon: HEK293T, wat miniSOG stabiel in mitochondria uitdruk, toon meer as 'n 8-voudige toename in sein vir probe 3, terwyl probe 2, wat in die CAP-seq RNA-etiketteringsmetode gebruik word, slegs toon ~2.5-voudige seinverhoging, waarskynlik as gevolg van verskillende reaktiwiteitsvoorkeure tussen RNA en proteïen (Fig. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， HEK293T 在 线 粒体 中 稳定 表达 Minisog ， 探针 3 的 信号 增加> 8 倍 ， 而 用 于 RNA 标记 方法 方法 Cap-Seq 的 探针 2 仅 显示 ~ ~ ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， HEK293T 在 粒体 中 稳定 表达 Minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 RNA 标记 Cap-EQ 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2.5 -倍信号增加，可能是由于RNAAnilien-gebaseerde chemiese probes 1 en 3 het beter spesifisiteit gehad, HEK293T het miniSOG in mitochondria stabiel uitgedruk, en probe 3 het meer as 8-voudige toename in sein gehad, terwyl probe 2 vir die CAP-seq RNA-etiketteringsmetode slegs ~2.5-voudige toename getoon het.in die sein, waarskynlik as gevolg van verskillende reaksievoorkeure tussen RNA en proteïen (Fig. 1b, c).Daarbenewens is sonde 3-isomere en hidrasienprobes (probes 5, 6, 7) getoets, wat die optimalisering van sonde 3 bevestig (Aanvullende Fig. 1b, c).Net so het in-gel fluoressensie-analise ander geoptimaliseerde eksperimentele parameters aan die lig gebring: bestralingsgolflengte (460 nm), chemiese sondekonsentrasie (1 mM) en bestralingstyd (20 min) (Aanvullende Fig. 2a-c).Die weglating van enige komponent of stap in die PDPL-protokol het gelei tot beduidende sein-omkering na die agtergrond (Fig. 1d).Opmerklik is dat proteïen-etikettering aansienlik verminder is in die teenwoordigheid van natriumasied of trolox, wat bekend is om enkelsuurstof te blus.Die teenwoordigheid van D2O, wat bekend is om singlet suurstof te stabiliseer, verbeter die etiketteringssein.Om die bydrae van ander reaktiewe suurstofspesies tot etikettering te ondersoek, is mannitol en vitamien C bygevoeg om onderskeidelik hidroksiel- en superoksied-radikale-afvangers te vestig, 18, 29, maar dit is nie gevind dat dit etikettering verminder nie.Byvoeging van H2O2, maar nie beligting nie, het nie tot etikettering gelei nie (Aanvullende Fig. 3a).Fluoresensie-singlet suurstofbeelding met Si-DMA probes het die teenwoordigheid van enkelsuurstof in die HEK293T-miniSOG-draad bevestig, maar nie in die oorspronklike HEK293T-draad nie.Daarbenewens kon mitoSOX Red nie superoksiedproduksie na beligting opspoor nie (Fig. 1e en Aanvullende Fig. 3b) 30. Hierdie data dui sterk daarop dat enkelsuurstof die hoofreaktiewe suurstofspesie is wat verantwoordelik is vir daaropvolgende proteomiese etikettering.Sitotoksisiteit van PDPL is beoordeel, insluitend blouligbestraling en chemiese probes, en geen beduidende sitotoksisiteit is waargeneem nie (Aanvullende Fig. 4a).
Ten einde die etiketteringmeganisme te bestudeer en proteomiese identifikasie van proteïenkomplekse met behulp van LC-MS/MS moontlik te maak, moet ons eers bepaal watter aminosure gemodifiseer word en die deltamassa van sondeetikette.Daar is berig dat metionien, histidien, triptofaan en tirosien deur enkelsuurstof14,15 gemodifiseer word.Ons integreer die TOP-ABPP31-werkvloei met die onbevooroordeelde oop soektog wat deur die FragPipe-rekenaarplatform gebaseer is op MSFragger32.Na enkelsuurstofmodifikasie en chemiese probe-etikettering, is kliekchemie uitgevoer deur gebruik te maak van 'n biotienreduksie-etiket wat 'n splitsbare skakelaar bevat, gevolg deur neutravidienstrek en tripsienvertering.Die gemodifiseerde peptied, wat steeds aan die hars gebind is, is fotogekloof vir LC-MS/MS-analise (Figuur 2a en Aanvullende Data 1).'n Groot aantal modifikasies het regdeur die proteoom plaasgevind met meer as 50 peptiedkaart (PSM) passings gelys (Fig. 2b).Verbasend genoeg het ons slegs modifikasie van histidien waargeneem, waarskynlik as gevolg van die hoër reaktiwiteit van geoksideerde histidien teenoor anilienprobes as ander aminosure.Volgens die gepubliseerde meganisme van histidienoksidasie deur enkelsuurstof,21,33 stem die voorgestelde delta-massastruktuur van +229 Da ooreen met die addukt van sonde 3 met 2-okso-histidien na twee oksidasies, terwyl +247 Da die hidroliseproduk is van +229 Da (Aanvullende Fig. 5).Die evaluering van die MS2-spektrum het 'n hoë betroubaarheid van identifikasie van die meeste van die y- en b-ione getoon, insluitend die identifikasie van gemodifiseerde fragment-ione (y en b) (Fig. 2c).Konteksanalise van die plaaslike volgorde van PDPL-gemodifiseerde histidiene het 'n matige motiefvoorkeur vir klein hidrofobiese residue by ±1 posisies geopenbaar (Aanvullende Fig. 4b).Gemiddeld is 1.4 histidiene per proteïen geïdentifiseer, en die plekke van hierdie merkers is bepaal deur oplosmiddeltoeganklike oppervlakte (SASA) en relatiewe oplosmiddel beskikbaarheid (RSA) analise (Aanvullende Fig. 4c,d).
'n Onpartydige werkvloei vir die bestudering van oorblywende selektiwiteit met behulp van die FragPipe-rekenaarplatform aangedryf deur MSFragger.Afsplitsbare skakelaars word in Click-chemie gebruik om fotosplitsing van gemodifiseerde peptiede van streptavidienhars toe te laat.'n Oop soektog is van stapel gestuur om talle wysigings te identifiseer, asook relevante oorblyfsels.b Ken die massa modifikasies wat deur die proteoom voorkom toe.Peptied kartering PSM.c MS2 spektrale annotasie van histidienplekke gemodifiseer met sonde 3. As 'n verteenwoordigende voorbeeld, 'n kovalente reaksie met sonde 3 het +229.0938 Da by die gemodifiseerde aminosuur gevoeg.d Mutasietoets wat gebruik word om vir PDPL-merkers te toets.PRDX3 (H155A, H225A) en PRDX1 (H10A, H81A, H169A) is getransfekteer met wild-tipe plasmiede vir anti-Vlag opsporing.e Die sintetiese peptied is gereageer met gesuiwerde miniSOG in die teenwoordigheid van probe 3 en die ooreenstemmende produkte met Δm +247 en +229 is in die LC-MS spektrum opgemerk.f In vitro proteïen-tot-proteïen-interaksies gemodelleer met miniSOG-6xHis-merker en anti-6xHis-teenliggaampies.Antibiotien (streptavidien-HRP) en anti-muis Western klad analise van miniSOG-6xHis/anti-6xHis teenliggaampie komplekse gemerk met sonde 3, afhangende van die tyd van blootstelling aan lig.Etikette vir individuele proteïene word uitgedruk in die ooreenstemmende molekulêre gewig: LC teenliggaam ligte ketting, HC teenliggaam swaar ketting.Hierdie eksperimente is ten minste twee keer onafhanklik herhaal met soortgelyke resultate.
Vir biochemiese verifikasie van die etiketteringsplek, is PRDX3 en PRDX1 geïdentifiseer deur massaspektrometrie verander van histidien na alanien en vergelyk met wilde tipe in transfeksie toetse.Die PDPL resultate het getoon dat die mutasie die etikettering aansienlik verminder het (Fig. 2d).Intussen is die peptiedvolgorde wat in die oop soektog geïdentifiseer is gesintetiseer en in vitro gereageer met gesuiwerde miniSOG in die teenwoordigheid van probe 3 en blou lig, wat produkte met 'n massaverskuiwing van +247 en +229 Da gelewer het wanneer dit deur LC-MS opgespoor word (Fig. . 2e).).Om te toets of interaktiewe proksimale proteïene in vitro gemerk kan word in reaksie op miniSOG-fotoaktivering, het ons 'n kunsmatige nabyheidstoets ontwerp deur interaksie tussen die miniSOG-6xHis-proteïen en 'n anti-His monoklonale teenliggaam in vitro (Figuur 2f).In hierdie toets het ons proksimale etikettering van teenliggaampies swaar en ligte kettings met miniSOG verwag.Trouens, anti-muis (herkenning van die swaar en ligte kettings van anti-6xHis-gemerkte teenliggaampies) en streptavidien Western blots het sterk biotinilering van die swaar en ligte kettings getoon.Veral, ons het miniSOG-outobiotinilering opgemerk as gevolg van die 6xHis-merker en kruiskoppelings tussen ligte en swaar kettings, wat verband hou met die voorheen beskryf gaping tussen lisien en 2-okso-histidien proksimale reaksie.Ten slotte kom ons tot die gevolgtrekking dat PDPL histidien op 'n nabyheidsafhanklike wyse verander.
Ons volgende doelwit was om die subsellulêre proteoom te karakteriseer om die spesifisiteit van in situ-etikettering te toets.Daarom het ons miniSOG stabiel uitgedruk in die kern, mitochondriale matriks, of buitenste ER-membraan van HEK293T-selle (Fig. 3a).Gel-fluoressensie-analise het oorvloedige gemerkte bande by drie subsellulêre liggings sowel as verskillende etiketteringpatrone aan die lig gebring (Fig. 3b).Fluoresensie beelding analise het hoë spesifisiteit van PDPL getoon (Fig. 3c).Die PDPL-werkvloei is gevolg deur klikreaksies met rhodamien-kleurstowwe om subsellulêre proteome te omlyn deur gebruik te maak van fluoressensiemikroskopie, en PDPL-seine is gekolokaliseer met DAPI, mitochondriale spoorsnyers of ER-spoorsnyers, wat die hoë getrouheid van PDPL bevestig.Vir die drie organel-liggings het 'n sy-aan-sy vergelyking van PDPL met TurboID met behulp van avidin western klad getoon dat PDPL meer spesifiek gemerk is in vergelyking met hul onderskeie kontroles.Onder PDPL toestande het meer gemerkte bande verskyn, wat meer PDPL-gemerkte proteïene aandui (Aanvullende Fig. 6a-d).
'n Skematiese voorstelling van miniSOG-gemedieerde organel-spesifieke proteoom-etikettering.miniSOG teiken die mitochondriale matriks via samesmelting na die N-terminale 23 aminosure van menslike COX4 (mito-miniSOG), die kern via samesmelting na H2B (nucleus-miniSOG), en Sec61β via die sitoplasmiese kant van die ER-membraan (ER-miniSOG) ).Indikasies sluit in gel-beelding, konfokale beelding en massaspektrometrie.b Verteenwoordigende jelbeelde van drie organelspesifieke PDPL-profiele.CBB Coomassie Briljant Blou.c Verteenwoordigende konfokale beelde van HEK293T-selle wat miniSOG stabiel uitdruk met verskillende subsellulêre lokalisasies opgespoor deur teenliggaampies gemerk V5 (rooi).Subsellulêre merkers word gebruik vir mitochondria en ER (groen).Die PDPL-werkvloei sluit die opsporing van miniSOG (geel) gemerkte subsellulêre proteome in deur gebruik te maak van Cy3-asied-kliekchemie.Skaalbalk: 10 µm.d Vulkaniese plotte van PDPL-gemerkte proteome in verskeie organelle gekwantifiseer deur ongemerkte kwantifisering (n = 3 onafhanklike biologiese eksperimente).Tweestert Student se t-toets is op vulkaan erwe gebruik.HEK293T wilde tipe is as 'n negatiewe kontrole gebruik. Aansienlik veranderde proteïene word in rooi uitgelig (p < 0.05 en >2-voudige ioonintensiteitsverskil). Aansienlik veranderde proteïene word in rooi uitgelig (p < 0.05 en >2-voudige ioonintensiteitsverskil). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 en >2-кратная разница in интенсивности ионов). Aansienlik veranderde proteïene word in rooi uitgelig (p < 0.05 en > 2-voudige verskil in ioonintensiteit).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 en > 2-кратная разница в ионной силе). Aansienlik veranderde proteïene word in rooi uitgelig (p < 0.05 en > 2-voudige verskil in ioniese sterkte).Verwante proteïene wat belangrik is vir HEK293T-miniSOG, maar nie belangrik vir HEK293T nie, word in groen getoon.e Analise van die spesifisiteit van proteomiese datastelle uit eksperimente d.Die totale aantal statisties beduidende proteïene in elke organel (rooi en groen kolletjies) word bo-aan gemerk.Histogramme toon proteïene gelokaliseer in organelle gebaseer op MitoCarta 3.0, GO-analise en A. Ting et al.mense.Afsonderlike datastelle vir mitochondria, kerne en ER.Hierdie eksperimente is ten minste twee keer onafhanklik herhaal met soortgelyke resultate.Rou data word verskaf in die vorm van rou data lêers.
Aangemoedig deur die jel- en beeldresultate, is etiketvrye kwantifisering gebruik om die geïdentifiseerde proteoom in elke organel te kwantifiseer (Aanvullende Data 2).Ongetransfekteerde HEK293T is as 'n negatiewe kontrole gebruik om agtergrondmerkers af te trek. Vulkaan plot-analise het aansienlik verrykte proteïene (p < 0.05 en > 2-voudige ioonintensiteit) sowel as enkeltonproteïene wat slegs teenwoordig is in miniSOG-uitdrukkingslyne (Fig. 3d rooi en groen kolletjies) vertoon. Vulkaan plot-analise het aansienlik verrykte proteïene (p < 0.05 en > 2-voudige ioonintensiteit) sowel as enkeltonproteïene wat slegs teenwoordig is in miniSOG-uitdrukkingslyne (Fig. 3d rooi en groen kolletjies) vertoon. Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Vulkaan plot analise het aansienlik verrykte proteïene getoon (p<0.05 en >2-voudige ioonintensiteit) sowel as enkelproteïene wat slegs teenwoordig is in miniSOG-uitdrukkingslyne (Fig. 3d, rooi en groen kolletjies).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 （P <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 以及 仅 存 在于 Minisog 表达 系 中 的 单一 蛋白质 （图 图 3D 红色 和 绿色点））。。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 Minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3D 红色 绿色点 。。。））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Vulkaanplot-analise het aansienlik verrykte proteïene (p<0.05 en >2x ioniese sterkte) sowel as enkele proteïene wat slegs in die miniSOG-uitdrukkingslyn teenwoordig was (rooi en groen kolletjies in Fig. 3d) aan die lig gebring.Deur hierdie data te kombineer, het ons onderskeidelik 1364, 461 en 911 statisties beduidende kern-, mitochondriale en ER-buitemembraanproteïene geïdentifiseer.Om die akkuraatheid van organel-gelokaliseerde PDPL te ontleed, het ons MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) analise, en A. Ting et al.'n datastel8 is gebruik vir mitochondria, kern en ER om die organel-spesifisiteit van die bespeurde proteïene te toets, wat ooreenstem met 'n akkuraatheid van 73.4, 78.5 en 73.0% (Fig. 3e).Die spesifisiteit van PDPL bevestig dat PDPL 'n ideale hulpmiddel is vir die identifisering van organel-spesifieke proteome.Opmerklik, submitochondriale analise van geïdentifiseerde mitochondriale proteïene het getoon dat die vasgevange proteoom hoofsaaklik in die matriks en binnemembraan (226 en 106, onderskeidelik) versprei is, wat verantwoordelik is vir 91.7% (362) van die totale aantal geïdentifiseerde mitochondriale proteïene.'n hoë vlak van PDPL is addisioneel bevestig (Aanvullende Fig. 7a).Net so het subnukleêre analise getoon dat die gevange proteoom hoofsaaklik in die kern, nukleoplasma en nukleolus versprei is (Aanvullende Fig. 7b).Kernproteomiese analise met 'n kernlokaliseringseinpeptied (3xNLS) het soortgelyke akkuraatheid as die H2B-konstruk getoon (Aanvullende Fig. 7c-h).Om die spesifisiteit van die PDPL merker te bepaal, is kernlaminien A gekies as 'n meer diskreet gelokaliseerde POI7 lokval.PDPL het 36 betekenisvol verrykte proteïene geïdentifiseer, waarvan 12 proteïene (30.0% insluitend lamine A) goed gekarakteriseerde lamine A-interaksieproteïene was wat deur die String-databasis geannoteer is, met 'n hoër persentasie as die BioID-metode (122 proteïene) 28 van 28. , 22.9 %) 7. Ons metode het minder proteïene geïdentifiseer, moontlik as gevolg van beperkte etiketteringareas, wat moontlik gemaak is deur meer aktiewe enkelsuurstof.GO-analise het getoon dat die geïdentifiseerde proteïene hoofsaaklik in die nukleoplasma (26), kernmembraan (10), kernmembraan (9) en kernporieë (5) geleë was.Gesamentlik was hierdie kern-gelokaliseerde proteïene verantwoordelik vir 80% van die verrykte proteïene, wat die spesifisiteit van PDPL verder demonstreer (Aanvullende Fig. 8a-d).
Nadat ons die vermoë van PDPL vasgestel het om nabyheidsmerke in organelle uit te voer, het ons toe getoets of PDPL gebruik kan word om POI-bindingsvennote te analiseer.Ons het veral gepoog om PDPL-analise van sitosoliese proteïene te definieer, wat as moeiliker teikens as hul membraan-gelokaliseerde eweknieë beskou word as gevolg van hul hoogs dinamiese aard.Die bromodomein en ekstraterminale (BET) proteïen BRD4 het ons aandag getrek vir sy sleutelrol in verskeie siektes 35, 36.Die kompleks wat deur BRD4 gevorm word, is 'n transkripsionele koaktiveerder en 'n belangrike terapeutiese teiken.Deur die uitdrukking van c-myc- en Wnt5a-transkripsiefaktore te reguleer, word daar gedink dat BRD4 'n sleuteldeterminant is van akute myeloïede leukemie (AML), veelvuldige myeloom, Burkitt se limfoom, kolonkanker en inflammatoriese siektes37,38.Daarbenewens teiken sommige virusse BRD4 om virale en sellulêre transkripsie te reguleer, soos papillomavirus, MIV en SARS-CoV-236,39.
Om die BRD4-interaksie met behulp van PDPL te karteer, het ons miniSOG gekombineer met 'n kort N- of C-terminale isovorm van BRD4.Proteomiese resultate het 'n hoë mate van oorvleueling tussen die twee konstrukte geopenbaar (Aanvullende Fig. 9a).Die kernproteoom wat met miniSOG-H2B geïdentifiseer is, dek 77.6% van die proteïene wat met BRD4 in wisselwerking tree (Aanvullende Fig. 9b).Dan is verskillende tye van beligting (2, 5, 10, 20 min) gebruik om die merkerradius aan te pas (Fig. 4a en aanvullende data 3).Ons kom tot die gevolgtrekking dat PDPL by korter fotoperiodes primêr direkte bindingsvennote sal etiketteer, terwyl langer periodes proteïene sal insluit wat tydens korter fotoaktiveringsperiodes geïdentifiseer is, sowel as indirekte teikens in etikettering van komplekse.Trouens, ons het sterk oorvleueling tussen aangrensende tydpunte gevind (84.6% vir 2 en 5 min; 87.7% vir 5 en 10 min; 98.7% vir 10 en 20 min) (Fig. 4b en Aanvullende Fig. 9c).In alle eksperimentele groepe het ons nie net BRD4-selfetikettering gevind nie, maar verskeie bekende teikens soos MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A en HMGB1 wat in die stringdatabasis geannoteer is.Die ioniese sterkte van hierdie teikens is eweredig aan die blootstellingstyd (Fig. 4c en Aanvullende Fig. 9d).GO-analise van die proteïene wat in die 2-minuut groep geïdentifiseer is, het getoon dat die geïdentifiseerde proteïene in die kern gelokaliseer was en betrokke was by chromatien hermodellering en RNA polimerase funksie.Die molekulêre funksie van die proteïen is verryk in chromatienbinding of transkripsionele koaktivering, in ooreenstemming met BRD4-funksie (Fig. 4d).Stringdatabasis-geaktiveerde proteïeninteraksie-analise het 'n eerste vlak van indirekte interaksies tussen BRD4- en HDAC-familie-interaksiekomplekse soos SIN3A, NCOR2, BCOR en SAP130 (Fig. 4e en Aanvullende Fig. 9e) aan die lig gebring, in ooreenstemming met BRD4- en HDAC-bindende asetileerde histone ..Daarbenewens is verteenwoordigende teikens geïdentifiseer deur LC-MS/MS, insluitend Sin3A, NSUN2, Fus en SFPQ, bevestig deur Western blotting (Fig. 4f).Onlangs is gerapporteer dat die kort isovorm van BRD4 kerne vorm met vloeistof-vloeistoffaseskeiding (LLPS) eienskappe.Die RNA-bindende proteïene Fus en SFPQ bemiddel die LLPS van verskeie sellulêre prosesse en is hier geïdentifiseer as ongetekende BRD4-bindende proteïene.Die interaksie tussen BRD4 en SFPQ is bevestig deur mede-immunopresipitasie (co-IP) eksperimente (Figuur 4g), wat 'n ander meganisme vir BRD4-gemedieerde vloeistof-vloeistof fase skeiding voorstel wat verdere ondersoek verdien.Saamgevat dui hierdie resultate daarop dat PDPL 'n ideale platform is vir die identifisering van bekende BRD4-interaksie sowel as onbekende bindende proteïene.
'n Skematiese voorstelling van miniSOG-gemedieerde BRD4 nabyheidsmerk, blootstellingstye: 2, 5, 10 en 20 min.b Oorvleueling van proteïene wat op verskillende beligtingstye geïdentifiseer is.Proteïenverryking wat in HEK293T-miniSOG-BRD4 geïdentifiseer is, was statisties betekenisvol in vergelyking met wildtipe HEK293T.c Ioonintensiteit wanneer ongemerkte verteenwoordigende bekende BRD4-bindende proteïene gedurende die gespesifiseerde blootstellingstyd gekwantifiseer word.n = 3 biologies onafhanklike monsters.Data word as gemiddelde ± standaardafwyking aangebied.d Geenontologiese analise (GO) van proteïene wat in die 2-minuut-groep geïdentifiseer is.Die eerste tien GO-terme word gelys.Borrels word gekleur volgens die GO-termkategorie, en borrelgrootte is eweredig aan die aantal proteïene wat in elke term gevind word.e Stringanalise van proteïene wat met BRD4 interaksie het.Die geel sirkels is direkte gom en die grys sirkels is die eerste laag indirekte gom.Die rooi lyne verteenwoordig die eksperimenteel bepaalde interaksies en die blou lyne verteenwoordig die voorspelde interaksies.f Verteenwoordigende BRD4-bindende teikens wat in LC-MS/MS geïdentifiseer is, is deur Western blotting geverifieer.g Ko-immunopresipitasie eksperimente bevestig die interaksie tussen SFPQ en BRD4.Hierdie eksperimente is ten minste twee keer onafhanklik herhaal met soortgelyke resultate.Rou data word verskaf in die vorm van rou data lêers.
Benewens die identifisering van ongeregistreerde POI-geassosieerde teikens, veronderstel ons dat PDPL geskik sal wees vir die identifisering van substrate vir ensieme, wat die karakterisering van indirekte bindende proteïene in groot komplekse sal vereis om ongeregistreerde substrate te annoteer.Parkin (gekodeer deur PARK2) is 'n E3-ligase en dit is bekend dat mutasies in parkin outosomaal resessiewe jong Parkinson se siekte (AR-JP)42 veroorsaak.Daarbenewens is parkin beskryf as noodsaaklik vir mitofagie (mitochondriale outofagie) en die verwydering van reaktiewe suurstofspesies.Alhoewel verskeie parkin-substrate geïdentifiseer is, bly die rol van parkin in hierdie siekte onduidelik.Om sy ongekarakteriseerde substrate te annoteer, is PDPL getoets deur miniSOG by die N- of C-terminus van parkin te voeg.Selle is met die karbonielsianied proton vervoerder m-chloorfenylhidrasoon (CCCP) behandel om parkien via die PINK1-Parkin pad te aktiveer.In vergelyking met ons BRD4 PDPL resultate, het parkin N-terminus samesmelting 'n groter stel teikenproteïene geopenbaar, hoewel dit 'n groter gedeelte van die C-terminus bedek het (177 uit 210) (Figuur 5a,b en aanvullende data 4).die resultaat stem ooreen met berigte dat N-terminale etikette Parkin44 afwykend kan aktiveer.Verbasend genoeg was daar net 18 oorvleuelende proteïene in ons data met gepubliseerde AP-MS-resultate vir Parkin43, waarskynlik as gevolg van verskille tussen sellyne en proteomika-werkvloei.Benewens vier bekende proteïene (ARDM1, HSPA8, PSMD14 en PSMC3) geïdentifiseer deur twee metodes (Fig. 5c)43.Om die resultate van LC-MS/MS verder te valideer, is PDPL-behandeling en daaropvolgende Western blotting gebruik om die resultate van die HEK293T ouerseltoets en die stabiele N-terminale parkienlyn te vergelyk.Voorheen onbekende teikens CDK2, DUT, CTBP1 en PSMC4 is getoets met 'n bekende bindmiddel, DNAJB1 (Fig. 5d).
Vulkaan plot van parkin-interaksie proteïene in HEK293T selle met stabiel uitgedrukte miniSOG saamgesmelt aan die N- of C-terminus van parkin (n = 3 onafhanklike biologiese eksperimente).Tweestert Student se t-toets is op vulkaan erwe gebruik.HEK293T is as 'n negatiewe kontrole gebruik. Aansienlik veranderde proteïene word in rooi uitgelig (p < 0.05 en >2-voudige ioonintensiteitsverskil). Aansienlik veranderde proteïene word in rooi uitgelig (p < 0.05 en >2-voudige ioonintensiteitsverskil). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 en >2-кратная разница in интенсивности ионов). Aansienlik veranderde proteïene word in rooi uitgelig (p < 0.05 en > 2-voudige verskil in ioonintensiteit).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 en > 2-кратная разница в ионной силе). Aansienlik veranderde proteïene word in rooi uitgelig (p < 0.05 en > 2-voudige verskil in ioniese sterkte).Verwante proteïene wat belangrik is vir HEK293T-miniSOG, maar nie belangrik vir HEK293T nie, word in groen getoon.b Venn-diagram wat oorvleuelende proteïene tussen N-terminale en C-terminale konstrukte toon.N-terminale merkers kan parkin afwykend aktiveer en lei tot meer herkenbare proteïene.c Venn-diagram wat oorvleuelende proteïene tussen PDPL en AP-MS toon.Bekende interaktors word gelys, insluitend 4 van 18 oorvleuelende proteïene en 11 van 159 proteïene wat spesifiek in PDPL geïdentifiseer is.d Verteenwoordigende teikens wat deur LC-MS/MS geïdentifiseer is, is deur Western blotting geverifieer.e Ssu72 en SNW1 is as ongeregistreerde parkin-substrate geïdentifiseer.Hierdie FLAG-gemerkte proteïenplasmiede is in HEK293T en HEK293T-Parkin-miniSOG getransfekteer, gevolg deur CCCP behandeling op verskeie tydpunte.Die agteruitgang was meer uitgesproke in die Parkin-ooruitdrukkingslyn.f Deur die proteasoom-inhibeerder MG132 te gebruik, is bevestig dat die afbraakproses van Ssu72 en SNW1 deur proteasoom-ubiquitinering bemiddel word.Hierdie eksperimente is ten minste twee keer onafhanklik herhaal met soortgelyke resultate.Rou data word verskaf in die vorm van rou data lêers.
Die proteïene wat deur PDPL geïdentifiseer word, moet veral parkin-bindende proteïene en hul substrate insluit.Om ongeregistreerde parkien-substrate op te spoor, het ons sewe geïdentifiseerde proteïene (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 en SNW1) en getransfekteerde plasmiede geselekteer om hierdie gene aan normale HEK293T bloot te stel en miniSOG-Parkin se behandeling met HEK293T stabiel uit te druk.Die vlakke van Ssu72 en SNW1 proteïene is aansienlik verminder in die stabiele miniSOG-Parkin lyn (Fig. 5e).Behandeling met CCCP vir 12 uur het gelei tot die mees betekenisvolle degradasie van beide substrate.Om te ondersoek of die afbraak van Ssu72 en SNW1 gereguleer word deur proteasoom-ubiquitinering, is die proteasoom inhibeerder MG132 bygevoeg om proteasoom aktiwiteit te inhibeer, en in werklikheid het ons gevind dat hul degradasie proses geïnhibeer is (Fig. 5f).Addisionele nie-substraat teikens is bevestig as Parkin interaktors met behulp van Western blotting (Aanvullende Fig. 10), wat konsekwente resultate met LC-MS/MS getoon het.Ten slotte, die integrasie van die PDPL-werkvloei met teikenproteïentransfeksieverifikasie laat die identifikasie van ongeregistreerde E3-ligase-substrate toe.
Ons het 'n gemeenskaplike nabyheidsmerkplatform ontwikkel wat jou toelaat om PVB's in ruimte en tyd te identifiseer.Die platform is gebaseer op die miniSOG-fotosensitiseerder-proteïen, wat net sowat 12 kDa is, minder as die helfte van die grootte van die volwasse APEX2-ensiem (27 kDa) en een derde die grootte van TurboID (35 kDa).Die kleiner grootte behoort die reeks toepassings vir die bestudering van klein proteïeninteraktome aansienlik uit te brei.Verdere verkenning van bykomende fotosensibiliseerders, hetsy geneties gekodeerde proteïene of klein molekules, is nodig om die kwantumopbrengs van enkelsuurstof te verhoog en die sensitiwiteit van hierdie benadering uit te brei.Vir die huidige weergawe van miniSOG kan hoë temporele resolusie bereik word deur blou beligting te gebruik om nabyheidsmerkers te aktiveer.Boonop het langer blootstellingstyd 'n groter "wolk" van enkelsuurstof vrygestel, wat gelei het tot modifikasie van meer distale histidienreste, verhoogde etiketteringradius en die vermoë om die PDPL ruimtelike resolusie te verfyn.Ons het ook sewe chemiese probes getoets om die sein-tot-agtergrond-verhouding te verhoog en die molekulêre meganisme agter hierdie benadering ondersoek.Die TOP-ABPP-werkvloei gekombineer met onbevooroordeelde oop soektog het bevestig dat modifikasies slegs in histidiene plaasgevind het en geen konsekwente mikro-omgewing is waargeneem vir verhoogde histidienmodifikasies nie, behalwe vir 'n matige voorkeur vir histidiene in die lusstreek.
PDPL is ook gebruik om subsellulêre proteome te karakteriseer met proteoomspesifisiteit en dekking wat ten minste vergelykbaar is met ander nabyheidsetikettering en organelspesifieke chemiese sondemetodes.Nabyheidsmerkers is ook suksesvol gebruik om die oppervlak-, lisosomale en sekretoom-geassosieerde proteome te karakteriseer46,47.Ons glo dat PDPL versoenbaar sal wees met hierdie subsellulêre organelle.Daarbenewens het ons PDPL uitgedaag deur teikens vir sitosoliese proteïenbinding te identifiseer wat meer kompleks is as membraangebonde proteïene as gevolg van hul dinamiese eienskappe en betrokkenheid by meer tydelike interaksies.PDPL is toegepas op twee proteïene, die transkripsionele koaktiveerder BRD4 en die siekte-geassosieerde ligase E3 Parkin.Hierdie twee proteïene is nie net gekies vir hul fundamentele biologiese funksies nie, maar ook vir hul kliniese relevansie en terapeutiese potensiaal.Vir hierdie twee PVB's is bekende bindende vennote sowel as ongeregistreerde teikens geïdentifiseer.Die faseskeiding-geassosieerde proteïen SFPQ is veral bevestig deur mede-IP, wat 'n nuwe meganisme kan aandui waardeur BRD4 (kort isovorm) LLPS reguleer.Terselfdertyd glo ons dat die identifikasie van Parkin-substrate 'n scenario is waarin die identifikasie van indirekte kleefmiddels vereis word.Ons het twee ongeïdentifiseerde parkin-substrate geïdentifiseer en hul agteruitgang langs die ubiquitination-proteasoom-weg bevestig.Onlangs is 'n meganisme-gebaseerde vangstrategie ontwikkel om hidrolase-substrate op te spoor deur dit met ensieme vas te vang.Alhoewel dit 'n baie kragtige metode is, is dit nie geskik vir die ontleding van substrate betrokke by die vorming van groot komplekse nie en vereis die vorming van kovalente bindings tussen die ensiem en die substraat.Ons verwag dat PDPL uitgebrei kan word om ander proteïenkomplekse en ensiemfamilies te bestudeer, soos die deubiquitinase en metalloprotease families.
'n Nuwe vorm van miniSOG, genaamd SOPP3, is ontwikkel met verbeterde enkelsuurstofproduksie.Ons het miniSOG met SOPP3 vergelyk en verbeterde merkprestasie gevind, hoewel die sein-tot-geraas-verhouding onveranderd gebly het (Aanvullende Fig. 11).Ons het veronderstel dat optimalisering van SOPP3 (bv. deur gerigte evolusie) sal lei tot meer doeltreffende fotosensibiliseerproteïene wat korter ligtye benodig en dus meer dinamiese sellulêre prosesse kan vasvang.Die huidige weergawe van PDPL is veral beperk tot die sellulêre omgewing aangesien dit blouligbeligting vereis en nie diep weefsels kan binnedring nie.Hierdie kenmerk sluit die gebruik daarvan in diermodelstudies uit.Die kombinasie van optogenetika met PDPL kan egter 'n geleentheid bied vir dierenavorsing, veral in die brein.Daarbenewens verwyder ander gemanipuleerde infrarooi fotosensibiliseerders ook hierdie beperking.Navorsing is tans op hierdie gebied aan die gang.
Die HEK293T-sellyn is verkry vanaf ATCC (CRL-3216).Die sellyn het negatief getoets vir mycoplasma infeksie en is gekweek in DMEM (Thermo, #C11995500BT) aangevul met 10% fetale bees serum (FBS, Vistech, #SE100-B) en 1% penisillien/streptomisien (Hyclone, #SV30010).ingegroei het.
3-Aminophenylene (monster 3) en (4-etinylphenyl)metanamine (monster 4) is van Bidepharm gekoop.Propylamine (sonde 2) is van Energy-chemicals gekoop.N-(2-Aminofeniel)pent-4-ynamied (probe 1) is volgens gepubliseerde metodes gesintetiseer.
Aanvullende Tabel 1 lys die genetiese konstrukte wat in hierdie studie gebruik is.Die miniSOG- en KillerRed-volgordes is vanaf 'n geskenkplasmied van P. Zou (Peking Universiteit) gekloon.Die mitochondriale matriks-teikenvolgorde is afgelei van die 23 N-terminale aminosure van COX4 en gekloneer in die aangeduide vektore met behulp van 'n Gibson-samestelling (Beyotime, #D7010S).Om die membraan en kern van die endoplasmiese retikulum te teiken, SEC61B menslike DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) geamplifiseer deur PCR vanaf 'n cDNA biblioteek van HEK293T selle, en H2B DNA (geskenk deur D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) en gekloon, soos hierbo genoem.Tensy anders aangedui, is ander proteïengene wat gebruik word vir transfeksie en konstruksie van stabiele sellyne PCR geamplifiseer vanaf die HEK293T sel cDNA biblioteek.G3S (GGGS) en G4S (GGGGS) is as skakelaars tussen die lokaasproteïen en miniSOG gebruik.'n V5 epitoop tag (GKPIPNPLLGLDST) is by hierdie samesmeltingskonstrukte gevoeg.Vir uitdrukking in soogdiere en om 'n stabiele sellyn te vestig, is die miniSOG-fusiekonstruksie in die pLX304 lentivirale vektor gesubkloneer.Vir bakteriële uitdrukking is miniSOG gekloneer in die pET21a vektor gemerk 6xHis by die C-terminus.
HEK293T-selle is gesaai teen 2.0 x 105 selle per put in ses-put plate en 24 uur later getransfekteer met rekombinante lentivirale plasmiede (2.4 μg pLX304) en virale verpakkingsplasmiede (1.5 μg psPAX2 en 1.2μg psPAX2 en 1.2 μg met Lipo2 . , #C0533), ongeveer 80% samesmelting.Na oornag transfeksie is die medium verander en vir nog 24 uur geïnkubeer.Die versameling van die virus is na 24, 48 en 72 uur uitgevoer.Voor infeksie van die teikensellyne is die virale medium deur 'n 0.8 μm filter (Merck, #millex-GP) gefiltreer en polibreen (Solarbio, #H8761) is bygevoeg tot 'n konsentrasie van 8 μg/ml.Na 24 uur is die selle toegelaat om te herstel deur die medium te verander.Selle is geselekteer deur gebruik te maak van 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) vir die eerste drie gedeeltes as 'n laer streng seleksie.Gebruik dan 20 μg/ml as 'n strenger regime vir die volgende drie gedeeltes.
Selle is gesaai in 12-put kamers (Ibidi, #81201) teen 'n digtheid van ongeveer 20,000 selle per put.Om adhesie van HEK293T-selle te verbeter, voeg 50 µg/ml fibronektien (Corning, #356008) verdun in fosfaatgebufferde soutoplossing (PBS, Sangon, #B640435) by 37°C.Die kamers is voorbehandel vir 1 uur en dan verwyder met PBS.Na 24 uur is selle een keer met PBS gewas, geïnkubeer met 1 mM sonde 3 in vars Hanks se gebalanseerde soutoplossing (HBSS, Gibco, #14025092) vir 1 uur by 37°C, en dan geïnkubeer met 'n blou LED (460 nm) ).) is vir 10 min by kamertemperatuur bestraal.Daarna is die selle twee keer met PBS gewas en gefixeer met 4% formaldehied in PBS (Sangon, #E672002) vir 15 minute by kamertemperatuur.Oormaat formaldehied is uit gefixeerde selle verwyder deur drie keer met PBS te was.Selle is dan gepermeabiliseer met 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) in PBS en 3 keer gewas met PBS.Verwyder dan die kamer en voeg by elke monster 25 µl van 'n klikreaksiemengsel wat 50 µM Cy3-asied (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) bevat. en 0,5 mg/ml natriumaskorbaat (Aladdin, no. S105024) en vir 30 minute by kamertemperatuur geïnkubeer.Na 'n vinnige reaksie is selle ses keer gewas met PBS wat 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) bevat en dan geblokkeer met 5% BSA (Abcone, #B24726) in PBST vir 30 minute by kamertemperatuur.
Vir kolokalisering immunokleuring, is selle geïnkubeer met primêre teenliggaampies volgens die aangeduide toestande: muis anti-V5 merker mAb (1:500, CST, #80076), konyn anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABklonaal, #A0564), konyn poliklonale anti-calnexin teenliggaampie (1:500, Abcam, #ab22595) of konyn anti-lamin A/C monoklonale teenliggaampie (1:500; CST, #2032) by 4 °C oornag.Nadat hulle 3 keer met PBST gewas is, is selle geïnkubeer met sekondêre teenliggaampies: bok anti-konyn Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) verdun 1:1000, bok anti-muis Alexa Fluor 594 (CST, #8889) verdun 1:1000.verdunning Verdun by kamertemperatuur vir 30 minute.Selle is dan 3 keer met PBST gewas en teenkleur met DAPI (Thermo, #D1306) in PBS vir 10 minute by kamertemperatuur.Na 3 wassings met PBS, is selle verseël in 50% gliserol (Sangon, #A600232) in PBS vir beelding.Immunofluorescerende beelde is verkry met behulp van 'n ZEISS LSM 900 Airyscan2 konfokale mikroskoop en ZNE 3.5 sagteware.
Vir singlet suurstof fluoresserende beelding, is selle twee keer met Hanks HEPES buffer gewas voordat 100 nM Si-DMA in Hanks HEPES buffer (DOJINDO, #MT05) bygevoeg is.Na blootstelling aan lig is die selle vir 45 minute in 'n CO2-broeikas by 37°C geïnkubeer.Selle is dan twee keer met Hanks se HEPES buffer gewas en teenkleur met Hoechst in Hanks se HEPES buffer vir 10 minute by kamertemperatuur en gevisualiseer met behulp van 'n ZEISS LSM 900 konfokale mikroskoop., #M36008) in HBSS-buffer wat kalsium en magnesium bevat.Na blootstelling aan lig of doksorubisien (MCE, #HY-15142A), is selle vir 10 minute in 'n CO2 broeikas by 37° C. geïnkubeer, twee keer met HBSS buffer gewas en met Hoechst in HBSS buffer by kamertemperatuur geïnkubeer.minute.Doksorubisien is as 'n positiewe probekontrole gebruik waar selle vir 30 min behandel is met 20 μM doksorubisien in HBSS wat 1% BSA bevat.Immunofluorescerende beelde is verkry met behulp van 'n Zeiss LSM 900 konfokale mikroskoop.
HEK293T-selle wat mito-miniSOG stabiel uitdruk, is gesaai teen 'n digtheid van ongeveer 30% in 15 cm-skottels.Na 48 uur, toe ~80% samevloeiing bereik is, is die selle een keer met PBS gewas, geïnkubeer met 1 mM Probe 3 in vars HBSS buffer vir 1 uur by 37°C en dan verlig met 'n blou LED vir 10 minute by kamer temperatuur..Daarna is die selle twee keer met PBS gewas, geskraap en hersuspendeer in yskoue PBS-buffer wat EDTA-vrye protease-inhibeerders bevat (MCE, #HY-K0011).Selle is gelys deur die punt vir 1 minuut te sonikerer (1 sekonde aan en 1 sekonde af teen 35% amplitude).Die resulterende mengsel is gesentrifugeer by 15,871 xg vir 10 minute by 4°C om puin te verwyder, en die supernatantkonsentrasie is aangepas na 4 mg/ml met behulp van 'n BCA-proteïentoetsstel (Beyotime, #P0009).Kombineer 1 ml van die bogenoemde lysaat met 0,1 mM foto-afbreekbare biotienasied (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA-ligand (Aladdin, #T162437), en 1 mM CuSO4-broeikas met onderste broeikas draai op vir 1 uur by kamertemperatuur.Na 'n vinnige reaksie, voeg die mengsel by die voorafgemengde oplossing (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) in 'n 10 ml glasflessie.Die monsters is gemeng en gesentrifugeer by 4500 g vir 10 minute by kamertemperatuur.Die onderste en boonste oplossings is weggegooi, die neerslag is twee keer gewas met 1 ml metanol en gesentrifugeer by 15871×g vir 5 min by 4°C.Voeg 1 ml 8 M ureum (Aladdin, no. U111902) in 25 mM ammoniumbikarbonaat (ABC, Aladdin, no. A110539) by om die neerslag op te los.Monsters is hersaamgestel met 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 in 25 mM ABC) vir 40 minute by 55°C gevolg deur die byvoeging van 15 mM vars joodasetamied (Sangon, #A600539) by kamertemperatuur in die donker.Alkylering binne 30 minute..'n Bykomende 5 mM dithiothreitol is bygevoeg om die reaksie te stop.Berei ongeveer 100 µl NeutrAvidin agarose-krale (Thermo, #29202) vir elke monster voor deur 3 keer te was met 1 ml PBS.Die bogenoemde proteoom oplossing is verdun met 5 ml PBS en geïnkubeer met vooraf gewasde NeutrAvidin agarose krale vir 4 uur by kamertemperatuur.Die krale is dan 3 keer gewas met 5 ml PBS wat 0.2% SDS bevat (Sangon, #A600485), 3 keer met 5 ml PBS wat 1M ureum bevat, en 3 keer met 5 ml ddH2O.Die krale is toe deur sentrifugering geoes en hersuspendeer in 200 μl 25 mM ABC wat 1 M ureum, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) en 20 ng/μl tripsien (Promega, #V5280) bevat.Tripsiniseer oornag by 37°C met rotasie.Die reaksie is gestop deur mieresuur (Thermo, # A117-50) by te voeg totdat die pH 2-3 bereik het.Die krale is 3 keer gewas met 1 ml PBS wat 0.2% SDS bevat, 3 keer met 1 ml PBS wat 1 M ureum bevat, en dan 3 keer met 1 ml gedistilleerde water.Die gemodifiseerde peptiede is vrygestel deur ligte lisis (365 nm) vir 90 min met behulp van 200 μl 70% MeOH.Na sentrifugering is die supernatant versamel.Die krale is dan een keer met 100 μl 70% MeOH gewas en die supernatante is saamgevoeg.Monsters is in 'n Speedvac vakuumkonsentrator gedroog en by -20°C gestoor tot ontleding.
Om singlet suurstof gemodifiseerde peptiede te identifiseer en te kwantifiseer, is monsters heroplos in 0.1% mieresuur en 1 μg peptiede is ontleed met behulp van 'n Orbitrap Fusion Lumos Tribrid massaspektrometer toegerus met 'n nano ESI bron van Tune en Xcalibur van verskaffer sagteware 4.3.Monsters is geskei op 'n 75 µm × 15 cm intern gepakte kapillêre kolom met 3 µm C18 materiaal (ReproSil-pur, #r13.b9.) en gekoppel aan 'n EASY-nLC 1200 UHPLC stelsel (Thermo).Die peptiede is geskei deur lineêre 95 minute gradiëntchromatografie van 8% oplosmiddel B tot 50% oplosmiddel B (A = 0.1% mieresuur in water, B = 0.1% mieresuur in 80% asetonitrile), dan lineêr verhoog tot 98% B min. in 6 min teen 'n vloeitempo van 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos versamel data afwisselend tussen volledige MS-skandering en MS2-skandering, afhangende van die data.Die sputterspanning is op 2.1 kV gestel en die temperatuur van die ioontransportkapillêre was 320°C.MS-spektra (350-2000 m/z) is versamel met 'n resolusie van 120,000, AGC 4 × 105, en 'n maksimum insettyd van 150 ms.Die 10 mees algemene meervoudig gelaaide voorlopers in elke volledige skandering is gefragmenteer deur gebruik te maak van HCD met 'n genormaliseerde botsingsenergie van 30%, 'n vierpool isolasie venster van 1.6 m/z, en 'n resolusie instelling van 30,000.'n AGC-teiken vir tandemmassaspektrometrie wat 5×104 en maksimum insettyd 150 ms gebruik.Die dinamiese uitsondering is op 30 sekondes gestel. Ontoegekende ione of dié met 'n lading van 1+ en >7+ is vir MS/MS verwerp. Ontoegekende ione of dié met 'n lading van 1+ en >7+ is vir MS/MS verwerp. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ontoegekende ione of ione met 'n lading van 1+ en >7+ is vir MS/MS verwerp.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ongespesifiseerde ione of ione met ladings van 1+ en >7+ is vir MS/MS verwerp.
Die rou data word verwerk met behulp van die FragPipe-rekenaarplatform gebaseer op MSFragger.Massa vooroordele en ooreenstemmende aminosure is bepaal deur gebruik te maak van 'n oop soekalgoritme met 'n voorloper massa toleransie van -150 tot 500 Da.Gemodifiseerde peptiede is dan geïdentifiseer deur gebruik te maak van histidien-modifikasies met massatoename van +229.0964 en +247.1069 Da in PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Selle wat die saamgesmelte miniSOG-geen stabiel uitdruk, is in 6 cm-skottels uitgeplaat.By bereiking van ~80% samevloeiing, is selle een keer gewas met HBSS (Gibco, #14025092), dan geïnkubeer met chemiese probes in HBSS vir 1 uur by 37°C en verlig met blou lig.10W LED vir 20 minute by kamertemperatuur.Om te bepaal watter tipe reaktiewe suurstofspesies by PDPL betrokke is, 0,5 mM vitamien C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 is as aanvullings by die selle gevoeg.Nadat met koue PBS gewas is, is selle geskraap, in 1,5 ml sentrifugebuisies versamel en vir 1 minuut met 'n punt gesoniceer in 200 μl PBS met 1x protease-inhibeerder sonder EDTA (1 s en 1 s sonder, amplitude 35%).Die resulterende mengsel is gesentrifugeer by 15,871 × g vir 10 minute by 4 °C en die supernatantkonsentrasie is aangepas na 1 mg/ml met behulp van 'n BCA-proteïentoetsstel.Ongeveer 50 µl van die bogenoemde lysaat is geïnkubeer met 0.1 mM rhodamienasied (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, en 1 mM CuSO4 vir 1 uur by kamertemperatuur met rotasie van onder na bo.Na die klikreaksie is presipitasie met asetoon uitgevoer deur 250 μl voorafverkoelde asetoon by die monsters te voeg, te inkubeer by -20°C vir 20 min en sentrifugeer by 6010×g vir 10 min by 4°C.Versamel die korrel en kook in 50 µl van 1x Laemmli se buffer vir 10 min by 95 °C.Monsters is dan op SDS-PAGE lang gels ontleed en gevisualiseer met behulp van die Bio-rad ChemiDoc MP Touch beeldingstelsel met Image Lab Touch sagteware.
Uitdrukking en suiwering van die rekombinante miniSOG-6xHis-proteïen is uitgevoer soos voorheen beskryf.Kortliks, E. coli BL21(DE3)-selle (TransGen, #CD701-02) is getransformeer met pET21a-miniSOG-6xHis en proteïenuitdrukking is geïnduseer met 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Na sellise is proteïene gesuiwer met behulp van Ni-NTA agarose krale (MCE, no. 70666), gedialiseer teen PBS, en by –80°C gestoor.
Vir 'n teenliggaam-gebaseerde in vitro etiket nabyheidstoets, meng 100 μM gesuiwerde miniSOG, 1 mM sonde 3, en 1 μg anti-etiket muis monoklonale teenliggaampie (TransGen, #HT501-01) in PBS tot 'n totale reaksie volume van 50 μl..Die reaksiemengsel is vir 0, 2, 5, 10 en 20 min by kamertemperatuur met blou LED-lig bestraal.Die mengsel is geïnkubeer met 0.1 mM biotien-PEG3-asied (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, en 1 mM CuSO4 vir 1 uur by kamertemperatuur op 'n opwaartse beweging skuder.Na 'n vinnige reaksie, voeg 4x Laemmli's buffer direk by die mengsel en kook by 95°C vir 10 min.Monsters is ontleed op SDS-PAGE gels en ontleed deur western klad met streptavidien-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
’n Histidien-bevattende sintetiese peptied met C-terminale amidering (LHDALDAK-CONH2) is gebruik om nabygeleë peptied-gebaseerde in vitro-etikettering te analiseer.In hierdie toets is 100 μM gesuiwerde miniSOG, 10 mM sonde 3 en 2 μg/ml sintetiese peptied in PBS gemeng in 'n totale reaksievolume van 50 μl.Die reaksiemengsel is vir 1 uur by kamertemperatuur met blou LED-lig bestraal.Een mikroliter monster is ontleed deur gebruik te maak van 'n LC-MS stelsel (Waters, SYNAPT XS Ione Mobiliteit Tyd-van-Vlug massaspektrometer met MassLynx spektrum analise sagteware).
HEK293T-selle wat die miniSOG-fusiegeen stabiel uitdruk, is in 10 cm-skottels gesaai vir lyne met verskillende organellokalisering (Mito, ER, Nucleus) en 15 cm-skottels vir Parkin-miniSOG en BRD4-miniSOG-lyne.Nadat ~90% samevloeiing bereik is, is die selle een keer met HBSS gewas, dan geïnkubeer met sonde 3 in HBSS vir 1 uur by 37°C en verlig met 'n 10 W blou LED by kamertemperatuur.Vir nie-kontak etikettering van Parkin, is 10 µM proton karboniel sianied draer m-chloorfenylhidrasoon CCCP (Solarbio, #C6700) met sonde 3 in HBSS bygevoeg vir 1 uur by 37°C.Die sellise, klikchemie, reduksie en alkileringsstappe was dieselfde as hierbo beskryf, behalwe dat 2 mg lysaat bygevoeg is en biotien PEG3-asied in die klikreaksie gebruik is in plaas van foto-afbreekbare biotienasied.Na verryking is die krale 3 keer gewas met 5 ml PBS wat 0.2% SDS bevat, 3 keer met 5 ml PBS wat 1 M ureum bevat, en 3 keer met 5 ml PBS.Daarna is 2 µg tripsien by 300 µl 25 mM ABC wat 1 M ureum bevat gevoeg om die proteïen oornag by 37°C te splits.Die reaksie is gestop deur mieresuur by te voeg totdat 'n pH van 2-3 bereik is.Na tripsinisering op krale, is die peptiedoplossing ontsout met behulp van 'n SOLAµ HRP-kolom (Thermo, #60209-001) en gedroog in 'n Speedvac-vakuumkonsentrator.Peptiede is heroplos in 0.1% mieresuur en 500 ng peptiede is ontleed met behulp van 'n Orbitrap Fusion Lumos Tribrid massaspektrometer toegerus met die nano-ESI bron hierbo beskryf.Peptiede is geskei op kommersiële RP-HPLC-voorkolomme (75 μm x 2 cm) (Thermo, no. 164946) en analitiese RP-HPLC-kolomme (75 μm x 25 cm) (Thermo, no. 164941), beide gevul met 2 μm.gradiënt van 8% tot 35% ACN in 60 minute, dan lineêr verhoog na 98% B in 6 minute teen 'n vloeitempo van 300 Nl/min.MS-spektra (350-1500 m/z) is versamel met 'n resolusie van 60 000, AGC 4 × 105, en 'n maksimum insettyd van 50 ms.Geselekteerde ione is opeenvolgend gefragmenteer deur HCD in 3 s siklusse met 'n genormaliseerde botsingsenergie van 30%, 'n kwadrupool isolasie venster van 1.6 m/z, en 'n resolusie van 15000. 'n 5 × 104 tandem massaspektrometer AGC teiken en 'n maksimum inspuittyd van 22 ms is gebruik.Die dinamiese uitsluiting is op 45 sekondes gestel. Ontoegekende ione of dié met 'n lading van 1+ en >7+ is vir MS/MS verwerp. Ontoegekende ione of dié met 'n lading van 1+ en >7+ is vir MS/MS verwerp. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ontoegekende ione of ione met 'n lading van 1+ en >7+ is vir MS/MS verwerp.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ongespesifiseerde ione of ione met ladings van 1+ en >7+ is vir MS/MS verwerp.
Die monstervoorbereidingstappe tot en met die verryking van die NeutrAvidin-krale was dieselfde as in die LC-MS/MS-analise hierbo beskryf.Ongeveer 50 μg lysaat is gebruik as toevoer vir laaibeheer en 2 mg lysaat is gebruik vir klikreaksies.Na verryking en was met neutravidien, is die gebonde proteïene geëlueer deur 50 μl van Laemmli se buffer by die agarose harskorrels te voeg en teen 95°C te kook vir 5 minute.Kontrolelading-insette en kraalverrykte monsters is deur SDS-PAGE ontleed en na PVDF-membrane (Millipore, #ISEQ00010) oorgedra deur standaard Western klad metodes.Die membrane is geblokkeer met 5% afgeroomde melk (Sangon, #A600669) in TBS wat 0.1% tussen-20 (TBST) bevat en opeenvolgend met primêre en sekondêre teenliggaampies geïnkubeer.Primêre teenliggaampies is 1:1000 verdun in 5% afgeroomde melk in TBST en oornag by 4°C geïnkubeer.Sekondêre teenliggaampies is in 'n verhouding van 1:5000 gebruik en vir 1 uur by kamertemperatuur geïnkubeer.Die membrane is gevisualiseer deur chemiluminesensie met behulp van die Chemidoc MP beeldingstelsel.Alle ongesnyde skanderings van vlekke en gels in die figuur word as rou data aangebied.
Primêre teenliggaampies wat in hierdie studie gebruik is, sluit in konyn anti-SFPQ monoklonale teenliggaampies (CST, no. 71992), konyn anti-FUS monoklonale teenliggaampie (CST, no. 67840), konyn anti-NSUN2 poliklonale teenliggaam (Proteintech, no. 20854-1) AP), konyn anti-mSin3A poliklonale teenliggaampie (Abcam, #ab3479), muis anti-merk monoklonale teenliggaam (TransGen, #HT201-02), muis anti-β-aktien monoklonale teenliggaam (TransGen, #HC201-01), konyn anti -CDK2 monoklonale teenliggaampie (ABklonaal, #A0094), konyn monoklonale teenliggaam teen CTBP1 (ABklonaal, #A11600), konyn poliklonale teenliggaam teen DUT (ABklonaal, #A2901), konyn poliklonale teenliggaampie teen PS54, #ABclonal-, #ABclonal- DNAJB1 poliklonale teenliggaampie (ABklonaal, # A5504).Hierdie teenliggaampies is gebruik teen 'n 1:1000 verdunning in 5% afgeroomde melk in TBST.Die sekondêre teenliggaampies wat in hierdie studie gebruik is, het anti-konyn IgG (TransGen, #HS101-01), anti-muis IgG (TransGen, #HS201-01) by 'n 1:5000 verdunning ingesluit.
Om verder te ondersoek of BRD4 met SFPQ in wisselwerking is, is stabiele HEK293T en BRD4-miniSOG-selle wat HEK293T ooruitdruk, in 10 cm-skottels uitgeplaat.Selle is gewas met koue PBS en geliseer in 1 ml Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, #87787) met EDTA-vrye protease inhibeerder vir 30 minute by 4°C.Daarna is die lysate in 1,5 ml sentrifugeerbuise versamel en by 15,871 xg vir 10 min by 4°C gesentrifugeer.Die supernatant is oornag by 4°C geoes en met 5 µg anti-V5-gemerkte muis monoklonale teenliggaampie (CST, #80076) geïnkubeer.Was ongeveer 50 µl proteïen A/G magnetiese krale (MCE, #HY-K0202) twee keer met PBS wat 0.5% Tween-20 bevat.Daarna is die sellysate vir 4 uur by 4°C met magnetiese krale geïnkubeer met rotasie van onder na bo.Daarna is die krale vier keer met 1 ml PBST-buffer gewas en vir 5 min by 95°C gekook.Monsters is ontleed op SDS-PAGE gels en oorgedra na PVDF membrane deur gebruik te maak van standaard Western klad metodes.Die membrane is in 5% afgeroomde melk in TBST geblokkeer en opeenvolgend met primêre en sekondêre teenliggaampies geïnkubeer.Primêre teenliggaam Konyn anti-SFPQ monoklonale teenliggaampie (CST, #71992) is gebruik teen 'n verhouding van 1:1000 in 5% afgeroomde melk in TBST en oornag by 4°C geïnkubeer.Anti-konyn IgG is gebruik teen 'n verhouding van 1:5000 en vir 1 uur by kamertemperatuur geïnkubeer.Die membrane is gevisualiseer deur chemiluminesensie met behulp van die Chemidoc MP beeldingstelsel.
Alle strukture wat vir die Oplosmiddel Toeganklike Oppervlakte-area (SASA) analise gebruik is, is verkry vanaf die Proteïendatabank (PDB)52 of die AlphaFold Proteïenstruktuurdatabasis53.Absolute SASA is vir elke residu bereken deur die FreeSASA-program te gebruik.Slegs volledige en ondubbelsinnige SASA-data vir gemerkte histidien en sy bure is gebruik om die gemiddelde SASA vir elke struktuur te verkry.Die relatiewe oplosmiddeltoeganklikheid (RSA) vir elke histidien is bereken deur die absolute SASA-waarde te deel deur die empiriese maksimum moontlike residu-oppervlakte beskikbaar vir die oplosmiddel.Alle histidiene is dan as verborge geklassifiseer as die gemiddelde RSA onder 20% was, andersins blootgestel56.
Rou lêers wat in DDA-modus verkry is, is deursoek met Proteome Discoverer (v2.5) of MSfragger (Fragpipe v15.0) in die toepaslike SwissProt-geverifieerde proteïendatabasis wat algemene kontaminante bevat.Die peptiede het volledige tripsien benodig met twee ontbrekende splitsingsplekke, karbamoielmetilering as 'n vaste modifikasie en metionienoksidasie as 'n dinamiese modifikasie.Voorloper- en fragmentgewigstoleransies is onderskeidelik op 10 dpm en 0.02 Da (MS2 Orbitrap) gestel. Kontaminanttreffers is verwyder, en proteïene is gefiltreer om 'n vals-ontdekkingsyfer van <1% te verkry. Kontaminanttreffers is verwyder, en proteïene is gefiltreer om 'n vals-ontdekkingsyfer van <1% te verkry. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфициента <1%. Kontaminanttreffers is verwyder en proteïene is gefiltreer om 'n vals-opsporingskoers van <1% te gee.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы for достижения уровня ложных <1%. Kontaminanttreffers is verwyder en proteïene is gefiltreer om 'n vals positiewe koers van <1% te behaal.Vir kwantitatiewe ontleding sonder die gebruik van etikette, is genormaliseerde proteïeninhoud van drie biologiese herhalings gebruik.Proteïen subsellulêre lokaliseringsanalise is uitgevoer met behulp van Gene Ontology (GO) analise van DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 en databasisse saamgestel en gepubliseer deur die Alice Ting groep.Die vulkaankaart is van Perseus (v1.6.15.0) verkry. Proteïen oorvloed vou veranderinge is getoets vir statistiese betekenisvolheid deur gebruik te maak van 'n tweesydige t-toets, en proteïen treffers is geïdentifiseer met oorvloed verandering >2 (tensy anders vermeld) en p waarde <0.05. Proteïen oorvloed vou veranderinge is getoets vir statistiese betekenisvolheid deur gebruik te maak van 'n tweesydige t-toets, en proteïen treffers is geïdentifiseer met oorvloed verandering >2 (tensy anders vermeld) en p waarde <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Proteïeninhoud vou veranderinge is getoets vir statistiese betekenisvolheid deur gebruik te maak van 'n twee-stert t-toets, en proteïen passings is geïdentifiseer met inhoud verandering >2 (tensy anders vermeld) en ap waarde <0.05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 有 说明） 和 P 值 <0.05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 P 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Statistiese betekenisvolheid van vouveranderinge in proteïeninhoud is getoets met 'n tweekantige t-toets, en proteïenpassings is bepaal vir inhoudsveranderinge >2 (tensy anders aangedui) en p-waardes <0.05.Proteïeninteraksie-analise is uitgevoer met behulp van GO-analise saam met die String-databasis.
Drie biologiese herhalings is uitgevoer met soortgelyke resultate.Statistiese analise is gedoen met GraphPad Prism (GraphPad sagteware) en vulkaan plotte is gegenereer met Perseus (v1.6.15.0).Om die twee groepe te vergelyk, is p-waardes bepaal met behulp van 'n tweekantige Student se t-toets.Slegs enkeltonproteïene wat ten minste twee keer in die eksperimentele groep geïdentifiseer is, is by die vulkaan plotte ingesluit, en die ooreenstemmende ontbrekende waardes in die kontrolegroep is vervang met Perseus vanaf 'n normale verspreiding sodat die p-waarde bereken kon word.Foutstawe verteenwoordig die gemiddelde ± standaardafwyking.In proteomiese ontledings vir statistiese analise is die oorvloed van proteïene wat in ten minste twee biologiese replikate verskyn het, behou.Statistiese metodes is nie gebruik om die steekproefgrootte vooraf te bepaal nie.Die eksperimente is nie lukraak nie.Die navorsers was nie blind vir die take tydens die eksperiment en evaluering van die resultate nie.
Vir meer inligting oor studie-ontwerp, sien die Natuurnavorsingsverslag-abstrak wat aan hierdie artikel gekoppel is.
Die massaspektrometrie-data wat in hierdie studie verkry is, is aan die ProteomeXchange-konsortium voorgelê via die iProX57-vennootbewaarplek onder datastel-ID PXD034811 (PDPL-MS-datastel).Rou data word verskaf in die vorm van rou data lêers.Hierdie artikel verskaf die oorspronklike data.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Om die buurt te leer ken: die gebruik van nabyheidsafhanklike biotinilering om proteïenkomplekse te karakteriseer en organelle te karteer. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Om die buurt te leer ken: die gebruik van nabyheidsafhanklike biotinilering om proteïenkomplekse te karakteriseer en organelle te karteer.Gingras, AS, Abe, KT en Raut, B. Vertroudheid met omgewing: gebruik van nabyheidsafhanklike biotinilering om proteïenkomplekse te karakteriseer en organelle te karteer. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Om die buurt te verstaan: gebruik die buurt se afhanklikheid van biologiese lewe.Gingras, AS, Abe, KT en Raut, B. Begrip van nabyheid: karakterisering van proteïenkomplekse en kartering van organelle met behulp van nabyheidsafhanklike biotinilering.Huidige.My opinie.Chemies.biologie 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Kartering van die mikro-omgewing deur Dexter-energie na immuunselle oor te dra.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Twee-proteoomskaalnetwerke bespeur selspesifieke hermodellering van die menslike interaktoom.Cells 184, 3022–3040.e3028 (2021).
Postyd: 15-Sep-2022
