Tradisionele diagnostiese strategieë vir die opsporing van aansteeklike siektes vereis die gebruik van bankinstrumente wat nie geskik is vir punt-van-sorg-toetsing (POCT) nie.Emerging microfluidics is 'n hoogs geminiaturiseerde, outomatiese en geïntegreerde tegnologie wat 'n potensiële alternatief is vir tradisionele metodes vir vinnige, laekoste, akkurate diagnostiek op die terrein.Molekulêre diagnostiese metodes word wyd gebruik in mikrofluïdiese toestelle as die mees effektiewe metodes vir patogeen opsporing.Hierdie oorsig gee 'n opsomming van onlangse vooruitgang in mikrovloeistof-gebaseerde molekulêre diagnostiek van aansteeklike siektes vanuit beide 'n akademiese en industriële perspektief.Eerstens beskryf ons 'n tipiese on-chip verwerking van nukleïensure, insluitend monstervoorbehandeling, amplifikasie en seinlesing.Die kenmerke, voordele en nadele van die vier tipes mikrofluïdiese platforms word dan vergelyk.Vervolgens sal ons die gebruik van digitale toetse vir die absolute kwantifisering van nukleïensure bespreek.Beide klassieke en onlangse kommersiële mikrofluïdiese-gebaseerde molekulêre diagnostiese toestelle word opgesom as bewys van die huidige stand van die mark.Ten slotte stel ons toekomstige rigtings voor vir mikrofluïdiese diagnose van aansteeklike siektes.
Aansteeklike siektes word veroorsaak deur patogene, insluitend bakterieë, virusse en parasiete, wat oor die hele wêreld versprei word.Anders as ander siektes, word patogene vinnig besmet en versprei tussen mense en gasheerdiere deur middel van inenting, lug en water media [1].Voorkoming van aansteeklike siektes is van kritieke belang as 'n openbare gesondheidsmaatreël.Drie hoofstrategieë vir die bekamping van aansteeklike siektes: (1) beheer die bron van infeksie;(2) onderbreking van die transmissiepad;(3) beskerming van vatbare bevolkings.Onder die hoofstrategieë word beheer van die bron van infeksie as die belangrikste strategie beskou as gevolg van die gerief en lae koste daarvan.Vinnige diagnose, isolasie en behandeling van besmette individue is van kritieke belang, wat vinnige, sensitiewe en akkurate diagnostiese strategieë vereis [2].Die huidige diagnose van aansteeklike siektes kombineer gewoonlik kliniese ondersoek gebaseer op tekens en simptome en laboratoriumstudies soos selkultuur en molekulêre diagnostiek, wat opgeleide personeel, arbeidsintensiewe prosedures en duur toetstoerusting vereis [3, 4].Voorkoming van uitbrake van aansteeklike siektes vereis vinnige, goedkoop en akkurate plaaslike diagnose, veral in gebiede met beperkte hulpbronne waar aansteeklike siektes algemeen en ernstig is [5], sowel as behandeling in die wildernis of op die slagveld, waar noodgevalle onvoorspelbaar is..mediese sorg is beperk [6].In hierdie konteks is mikrofluidika 'n tegnologie wat mikro-elektromeganiese stelseltegnologieë, nanotegnologie of materiaalwetenskap kombineer vir presiese vloeistofmanipulasie [7,8,9,10], wat nuwe moontlikhede bied vir punt-van-sorg-opsporing (POCT).) aansteeklike middels buite hospitale en laboratoriums.In vergelyking met tradisionele tydrowende diagnostiek, bied mikrofluïdiese tegnologie monster- en kostebesparings vir molekulêre diagnostiek tydens siekte-uitbrekings.Die wêreldwye verspreiding van koronavirussiekte 2019 (COVID-19) word veroorsaak deur ernstige akute respiratoriese sindroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), dus word die belangrikheid van mikrofluidika vir die tydige voorkoming en beheer van die pandemie weer beklemtoon [11, 12 , 13].Anders as tradisionele diagnostiek, gebruik mikrofluïdiese POCT klein draagbare toestelle wat wissel van tafelontleders tot klein systroom-toetsstrokies om naby die monsternemingspunt te toets [14].Hierdie toetse bevat simplistiese of geen monstervoorbereiding, vinnige seinversterking en sensitiewe seinlesings wat lei tot kort tydsduur en akkurate resultate binne minute.Die beskikbaarheid en massaproduksie van mikrovloeistofgebaseerde gesondheidsorginstrumente het hul kostedoeltreffende en direkte diagnostiese toepassings buite die hospitaal, naby die pasiënt en selfs by die huis uitgebrei.
Onder die bestaande strategieë vir die diagnose van aansteeklike siektes, is molekulêre diagnostiek een van die mees sensitiewe [15, 16].Daarbenewens word molekulêre diagnostiek dikwels gebruik as die goue standaard vir deurlopende opsporing van COVID-19, wat direkte opsporing van virusspesifieke streke van RNA of DNA moontlik maak voor die aanvang van 'n immuunrespons [17, 18].In die huidige oorsig, bied ons die jongste vooruitgang in mikrofluïdika-gebaseerde molekulêre diagnostiese prosesse vir aansteeklike siektes, van 'n akademiese perspektief tot toekomstige industriële perspektiewe (Fig. 1).Ons sal begin met drie sleutelstappe in nukleïensuuropsporing: voorbehandeling op die skyfie monster, nukleïensuurversterking en seinlesing.Ons het toe verskillende tipes mikrofluïdiese platforms met hul struktuur en funksie vergelyk, wat unieke eienskappe (sterk- en swakpunte) toon.Digitale nukleïensuuropsporing word verder bespreek en gegee as 'n voorbeeld van 'n derde generasie tegnologie vir die absolute kwantifisering van aansteeklike patogeenmolekules.Daarbenewens sal verskeie tipiese en nuutste kommersiële POCT-toestelle aangebied word om die huidige stand van die mikrofluïdiese POCT-mark vir molekulêre diagnostiek te demonstreer.Ons sal ook ons visie vir toekomstige toepassings bespreek en verduidelik.
Modules van mikrofluïdiese skyfies vir nukleïensuuropsporing kan in drie kategorieë (steekproefneming, herkenning en sein) verdeel word volgens hul funksies [19].Onder hierdie modules realiseer die monsternemingsmodule hoofsaaklik monsterlise en nukleïensuurekstraksie.Die sensormodule beheer hoofsaaklik die omskakeling en versterking van nukleïensuurseine.Die seinmodule bespeur die sein wat deur die waarnemingsmodule omgeskakel en verwerk is.Gebaseer op die proses om nukleïensure op 'n skyfie op te spoor, sal ons die verskillende skyfies opsom wat die "invoer en uitset"-funksie kan realiseer.
Die eerste stap in nukleïensuuropsporing is nukleïensuurekstraksie, dit wil sê om die teikennukleïensuur van die oorspronklike monster te isoleer.Nukleïensuur-ekstraksie word uitgevoer om nukleïensure van ander molekulêre kontaminante te suiwer, die integriteit van die primêre struktuur van nukleïensuurmolekules te verseker en resultate te optimaliseer.Nukleïensuurekstraksie vereis die nodige monsterlisis en nukleïensuuropvang, waarvan die kwaliteit en doeltreffendheid 'n groot impak op navorsing en diagnostiese resultate het.Enige subtiele newe-effekte tydens ekstraksie kan verdere opsporing beperk.Byvoorbeeld, polimerase kettingreaksie (PCR) en lus isotermiese amplifikasie (LAMP) metodes word geïnhibeer deur sommige oorblywende organiese oplosmiddels soos etanol en isopropanol in nukleïensuur isolasie reagense [20].Vloeistof-vloeistof-ekstraksie en vastefase-ekstraksie is die gewildste metodes om nukleïensure te isoleer [21], maar vloeistof-vloeistof-ekstraksie op 'n skyfie is uiters beperk, aangesien die reagense wat in vloeistof-vloeistof-ekstraksie gebruik word, korrosie van die meeste mikrofluïdiese skyfies veroorsaak .Hier beklemtoon ons mikroskikking-gebaseerde vastefase-ekstraksiemetodes en vergelyk hul voordele en nadele.
Silikon is 'n substraatmateriaal wat versoenbaar is met nukleïensure as gevolg van sy bioversoenbaarheid, stabiliteit en gemak van modifikasie [22].Wat belangrik is, wanneer dit met silika of ander materiale gemodifiseer word, vertoon hierdie saamgestelde eienskappe om negatief gelaaide nukleïensure te adsorbeer onder lae pH, hoë souttoestande terwyl dit met hoë pH, lae soutoplossings elueer word.Op grond van hierdie verskynsel is dit moontlik om die nukleïensuur te suiwer.
Verskeie vorme van silika-gebaseerde materiale is gebruik vir nukleïensuur-ekstraksie in mikrofluidika, soos silika-krale, poeiers, mikroveselfilters en silika-membrane [23, 24, 25, 26].Afhangende van die eienskappe van die materiaal, kan silikon-gebaseerde materiale op verskillende maniere in mikrokringe gebruik word.Silikakorrels, poeiers en kommersiële nanofilters kan byvoorbeeld eenvoudig in die porieë of mikrokanale van mikrofluïdiese skyfies geplaas word en help om nukleïensure uit monsters te onttrek [27, 28, 29].Oppervlakgemodifiseerde silikamembrane kan ook gebruik word om DNS vinnig van patogene teen lae koste te suiwer.Byvoorbeeld, Wang et al.[30] Deur denaturerende amplifikasiereaksies met vesikel-gemedieerde kettinguitruiling te kombineer met silikamembrane wat met chitosan-oligosakkariede bedek is, is 'n veelsydige draagbare stelsel ingestel wat 102–108 kolonievormende eenhede suksesvol opgespoor het.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., en die teenwoordigheid van die virus was maklik sigbaar.Powell et al.[31] Silikon-gebaseerde mikroskikkings is toe gebruik om hepatitis C-virus (HCV), menslike immuniteitsgebrekvirus (MIV), Zika-virus en menslike papillomavirus op te spoor en outomatiese voortplanting, waarin 'n 1,3 μl kronkelende mikroreaktor ontwikkel is om RNA-virusse vas te vang.en voer in situ versterking uit.Benewens hierdie metodes speel oppervlak-gemodifiseerde silika-mikrokolomme ook 'n sleutelrol in nukleïensuurekstraksie, aangesien die geometrie en eienskappe van die modifiserende materiaal die ekstraksiedoeltreffendheid aansienlik verhoog.Chen et al.[32] het 'n mikrofluïdiese platform voorgestel vir isolasie van lae-konsentrasie RNA gebaseer op amino-bedekte silikon mikrokolomme.Hierdie mikrofluïdiese toestel integreer 'n reeks van 0.25 cm2 mikropilare op 'n silikon substraat om hoër ekstraksie doeltreffendheid te bereik deur 'n hoë oppervlak area tot volume verhouding ontwerp.Die voordeel van hierdie ontwerp is dat die mikrofluïdiese toestel tot 95% nukleïensuur-ekstraksiedoeltreffendheid kan bereik.Hierdie silikon-gebaseerde strategieë demonstreer die waarde van vinnige isolering van nukleïensure teen lae koste.In kombinasie met mikrofluïdiese skyfies kan silikon-gebaseerde ekstraksiestrategieë nie net die doeltreffendheid van nukleïensuuropsporing verhoog nie, maar ook die miniaturisering en integrasie van analitiese toestelle vergemaklik [20].
Magnetiese skeidingsmetodes gebruik magnetiese deeltjies om nukleïensure in die teenwoordigheid van 'n eksterne magnetiese veld te isoleer.Algemeen gebruikte magnetiese deeltjies sluit Fe3O4 of γ-Fe2O3 magnetiese deeltjies in wat bedek is met silika, amino en karboksiel [33,34,35,36].Die onderskeidende kenmerk van magnetiese deeltjies in vergelyking met silikon-gebaseerde SPE-metodes is die gemak van manipulasie en beheer met eksterne magnete.
Met behulp van die elektrostatiese interaksie tussen nukleïensure en silika, onder toestande van hoë sout en lae pH, word nukleïensure op die oppervlak van silika-bedekte magnetiese deeltjies geadsorbeer, terwyl onder toestande van lae sout en hoë pH, die molekules gewas kan word weer..Silika-bedekte magnetiese krale maak dit moontlik om DNA uit groot volume monsters (400 μL) te onttrek met behulp van magneties beheerde beweging [37].As 'n demonstrasie het Rodriguez-Mateos et al.[38] het verstelbare magnete gebruik om die oordrag van magnetiese krale na verskillende kamers te beheer.Gebaseer op silika-bedekte magnetiese deeltjies, kan 470 kopieë/ml van SARS-CoV-2 genomiese RNA uit afvalwatermonsters onttrek word vir LAMP omgekeerde transkripsie opsporing (RT-LAMP) en die reaksie kan binne 1 uur gelees word.blote oog (Fig. 2a).
Toestelle gebaseer op magnetiese en poreuse materiale.Konseptuele diagram van die IFAST RT-LAMP mikrofluïdiese toestel vir SARS-CoV-2 RNA opsporing (aangepas vanaf [38]).b Sentrifugale mikrotoestel vir dSPE van bukkale deppernukleïensuur (aangepas uit [39]).c Ingeboude selfaangedrewe monsterkonsentrator wat 'n FTA®-kaart gebruik (aangepas vanaf [50]).d Fusion 5 filtreerpapier gemodifiseer met chitosan (aangepas vanaf [51]).SARS-CoV-2 ernstige akute respiratoriese sindroom koronavirus 2, RT-LAMP omgekeerde transkripsie lus bemiddelde isotermiese versterking, FTA vinders tegnologie vennote, NA nukleïensuur
Positief gelaaide magnetiese deeltjies is ideaal om die fosfaatruggraat van 'n nukleïensuur te heg.By 'n sekere soutkonsentrasie kan die negatief gelaaide fosfaatgroepe van nukleïensure positief gelaai word op die oppervlak van die magnetiese saamgestelde deeltjies.Daarom is magnetiese nanopartikels met 'n growwe oppervlak en 'n hoë digtheid van aminogroepe ontwikkel vir die ekstraksie van nukleïensure.Na magnetiese skeiding en blokkering kan magnetiese nanopartikels en DNA-komplekse direk in PCR gebruik word, wat die behoefte aan komplekse en tydrowende suiwerings- en elueringsoperasies uitskakel [35].Magnetiese nanopartikels bedek met negatiewe karboksielgroepe is ook gebruik om nukleïensure geadsorbeer op oppervlaktes in hoë konsentrasie poliëtileenglikol en natriumchloriedoplossings te skei [36].Met hierdie oppervlak-gemodifiseerde magnetiese krale is DNA-ekstraksie versoenbaar met daaropvolgende amplifikasie.Dignan et al.[39] het 'n outomatiese en draagbare sentrifugale mikrofluïdiese platform vir nukleïensuurvoorbehandeling beskryf, wat nie-tegniese personeel in staat stel om dit op die terrein te gebruik.Daarbenewens demonstreer die verenigbaarheid van die geïsoleerde DNA met LAMP, 'n metode wat goed geskik is vir punt-van-sorg nukleïensuuranalise, minimale toerustingvereistes en geskiktheid vir kolorimetriese toetse (Fig. 2b).
Magnetiese krale metodes bied die moontlikheid van outomatiese ekstraksie, waarvan sommige bestaan in kommersiële outomatiese nukleïensuur ekstraktors [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, VSA), QIAcube® HT;CapitalBio (Beijing, China) en Biomek®;Beckman (Miami, VSA).), Florida, VSA)].Die voordele van die kombinasie van magnetiese krale met mikrofluidika kan gebruik word vir doeltreffende outomatiese onttrekking van nukleïensure, wat moontlik die ontwikkeling van molekulêre diagnostiek kan bevorder;die kombinasie van magnetiese krale met mikrofluïdika steun egter steeds sterk op komplekse beheerstelsels vir presiese manipulasie van magnetiese krale, wat die gewildheid verklaar dat kommersiële produkte lywig en duur is, wat die verdere toepassing van magnetiese krale in POCT beperk.
Verskeie poreuse materiale soos gemodifiseerde nitrosellulose filters, Finders Technology Associates (FTA) kaarte, poliëtersulfon-gebaseerde filtreerpapiere en glikaan-bedekte materiale is ook gebruik vir nukleïensuuropsporing [40, 41, 42, 43, 44].Poreuse veselagtige materiale soos veselagtige papier is die eerste keer gebruik om DNA te isoleer deur langstrengige DNA-molekules fisies met vesels te verstrengel.Klein porieë lei tot 'n sterk fisiese beperking van DNS-molekules, wat DNS-ekstraksie positief beïnvloed.As gevolg van die verskillende poriegroottes van veselagtige papier, kan die ekstraksiedoeltreffendheid nie aan die behoeftes van DNA-amplifikasie voldoen nie [45, 46].Die FTA-kaart is 'n kommersiële filtreerpapier wat in die veld van forensiese medisyne gebruik word en wyd gebruik word in ander gebiede van molekulêre diagnostiek.Deur die gebruik van sellulose filtreerpapier wat met verskeie chemikalieë geïmpregneer is om die selmembrane in die monster te lyseer, word die vrygestelde DNA vir tot 2 jaar teen afbraak beskerm.Meer onlangs is geïmpregneerde sellulosepapier ontwikkel vir molekulêre opsporing van verskeie patogene, insluitend SARS-CoV-2, leishmaniasis en malaria [47,48,49].MIV in die geïsoleerde plasma word direk gelys, en die virale nukleïensuur word verryk in die FTA®-vloeimembraan wat in die konsentrator ingebou is, wat doeltreffende produksie van die nukleïensuur moontlik maak [50] (Fig. 2c).Die hoofprobleem met nukleïensuuropsporing met behulp van FTA-kaarte is dat chemikalieë soos guanidien en isopropanol daaropvolgende amplifikasiereaksies inhibeer.Om hierdie probleem op te los, het ons Fusion 5 chitosan-gemodifiseerde filtreerpapier ontwikkel, wat die voordele kombineer van beide die fisiese verweefdheid van DNA-molekules en veselagtige filtreerpapier, en die elektrostatiese adsorpsie van DNA op chitosan-gemodifiseerde verbindings om hoogs doeltreffende nukleïensuur-ekstraksie te verkry. ..filtervesels [51] (Fig. 2d).Net so het Zhu et al.[52] het 'n chitosan-gemodifiseerde PCR-metode gedemonstreer wat gebaseer is op 'n in situ kapillêre mikrovloeistofstelsel vir vinnige isolasie en opsporing van Zika-virus-RNA.Nukleïensure kan onderskeidelik geadsorbeer/gedesorbeer word in 'n gemengde lisaat/PCR medium, gebaseer op die aan/af skakelaar eienskap van chitosan.aan en af”, reageer op pH.
Soos hierbo genoem, kombineer hierdie strategieë die voordele van verskeie vastefase-materiale en verhoog die doeltreffendheid van nukleïensuurekstraksie in mikrovloeistowwe.In praktiese toepassings is die gebruik van hierdie materiale in groot hoeveelhede onekonomies, en behoorlike oppervlakbehandeling of oppervlakmodifikasie van algemene materiale met hierdie materiale kan ook hul funksie behou.Daarom word geglo dat die implementering van hierdie strategieë na 'n loodsstudie koste kan verminder.
Nukleïensuurtoetsing op mikrofluïdiese platforms gebruik dikwels klein monstervolumes (< 100 µl), vereis dus amplifikasie van die teikennukleïensure met spesifieke probes vir omskakeling na 'n sein wat gerieflik is vir stroomaf-opsporing (opties, elektries en magneties) [53, 54]. Nukleïensuurtoetsing op mikrofluïdiese platforms gebruik dikwels klein monstervolumes (< 100 µl), vereis dus amplifikasie van die teikennukleïensure met spesifieke probes vir omskakeling na 'n sein wat gerieflik is vir stroomaf-opsporing (opties, elektries en magneties) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Wanneer nukleïensure op mikrofluïdiese platforms getoets word, word klein monstervolumes (<100 µL) dikwels gebruik, dus die amplifikasie van teikennukleïensure met spesiale probes is nodig om dit om te skakel in 'n sein wat gerieflik is vir daaropvolgende opsporing (opties, elektries en magneties) [53, 54].微流控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小样本量 （<100 µl） ， 因此 需要 使用 特定 探针 扩增 目标 核酸 ， 以 转换 为 便于 下游 检测 （光学 、 电学 和 磁学） 的 信号 [53, 54 ].微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 信号 [53, 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Opsporing van nukleïensure op mikrofluïdiese platforms gebruik gewoonlik klein monstervolumes (<100 μl), wat amplifikasie van teikennukleïensure met spesiale probes vereis om dit in seine om te skakel vir daaropvolgende opsporing (opties, elektries en magneties) [53, 54]] .Nukleïensuurversterking in mikrofluidika kan ook reaksies versnel, opsporingslimiete optimaliseer, monstervereistes verminder en opsporing akkuraatheid verbeter [55, 56].In onlangse jare, met die verwesenliking van vinnige en akkurate opsporing, is verskeie nukleïensuur-amplifikasiemetodes in mikrofluidika toegepas, insluitend PCR en sommige isotermiese amplifikasiereaksies.Hierdie afdeling sal metodes vir nukleïensuuropsporing opsom, gebaseer op mikrofluïdiese stelsels.
PCR is 'n simulasie van die DNA-replikasieproses van 'n organisme, waarvan die teorie elders in detail beskryf word en nie hier bespreek sal word nie.PCR kan 'n baie klein hoeveelheid teiken DNA/RNA teen 'n eksponensiële tempo versterk, wat PCR 'n kragtige instrument maak vir die vinnige opsporing van nukleïensure.In onlangse dekades is baie draagbare mikrofluïdiese toestelle toegerus met PCR termiese fietsrystelsels ontwikkel om aan die behoeftes van punt-van-sorg diagnostiek te voldoen [57, 58].On-chip PCR kan verdeel word in vier tipes (konvensionele, deurlopende vloei, ruimtelik geskakelde en konvektiewe PCR) volgens verskillende temperatuurbeheermetodes [59].Byvoorbeeld, Gee et al.[60] het 'n direkte omgekeerde transkripsie kwantitatiewe PCR (RT-qPCR) metode op hul eie mikrofluïdiese platform ontwikkel vir die multipleksopsporing van SARS-CoV-2, influensa A en B virusse in keel depper monsters (Fig. 3a).Park et al.[61] het 'n eenvoudige patogeen-analiseskyfie gebou deur dunfilm-PCR, elektrodes en 'n vinger-aangedrewe polidimetielsiloksaan-gebaseerde mikrofluïdiese module te integreer.Beide werke beliggaam egter die algemene tekortkominge van konvensionele PCR.PCR vereis termiese siklusse, wat verdere toestelminiaturisering en verminderde toetstyd beperk.
Die ontwikkeling van deurlopende vloei-gebaseerde mikrofluïdiese en ruimte-geskakelde PCR is van kritieke belang om hierdie probleem aan te spreek.Deur 'n lang slangkanaal of 'n kort reguit kanaal te gebruik, kan deurlopende vloei PCR vinnige versterking verskaf deur reagense aktief in drie voorverhittingsones te sirkuleer met 'n off-chip pomp.Hierdie bewerking vermy die oorgangsfase tussen verskillende reaksietemperature suksesvol en verminder dus die toetstyd aansienlik [62] (Fig. 3b).In 'n ander studie deur Jung et al.[63] het 'n nuwe roterende PCR genetiese ontleder voorgestel wat die eienskappe van vaste en vloei PCR kombineer vir ultravinnige en multipleks omgekeerde transkripsie PCR (Fig. 3c).Vir nukleïensuuramplifikasie sal die PCR-mikroskyfie deur drie verhittingsblokke by verskillende temperature geroteer word: 1. Denatureringsblok 94°C, 2. Uitgloeiblok by 58°C, 3. Ekspansieblok by 72°C.
Toepassing van PCR in mikrofluidika.Skematiese voorstelling van dirRT-qPCR op 'n mikrofluïdiese platform (aangepas vanaf [60]).b Skematiese voorstelling van 'n kontinue vloei PCR mikroskikking gebaseer op 'n serpentynkanaal (aangepas vanaf [62]).c Skematiese voorstelling van 'n roterende PCR genetiese ontleder, bestaande uit 'n mikroskyfie, drie verwarmingsblokke en 'n stapmotor (aangepas uit [63]).d Diagram van termokonveksie PKR met sentrifugering en opstelling (aangepas vanaf [64]).DirRT-qPCR, direkte kwantitatiewe omgekeerde transkripsie polimerase kettingreaksie
Deur kapillêre en lusse of selfs dun plate te gebruik, kan konveksie-PKR nukleïensure vinnig versterk deur natuurlike vrye termiese konveksie sonder die behoefte aan 'n eksterne pomp.Byvoorbeeld, 'n sikliese olefien polimeer mikrofluïdiese platform is ontwikkel op 'n vervaardigde roterende verwarming stadium wat termiese siklusse met sentrifugering in 'n PCR lus mikrokanaal gebruik [64] (Fig. 3d).Die reaksie-oplossing word aangedryf deur termiese konveksie, wat voortdurend hoë en lae temperatuur in 'n mikrokanaal met 'n ringvormige struktuur uitruil.Die hele amplifikasieproses kan binne 10 minute voltooi word met 'n opsporingslimiet van 70.5 pg/kanaal.
Soos verwag, is vinnige PCR 'n kragtige instrument vir volledig geïntegreerde monster-reaksie molekulêre diagnostiese en multipleks analise stelsels.Vinnige PCR verminder die tyd wat nodig is om SARS-CoV-2 op te spoor aansienlik, wat bydra tot die doeltreffende beheer van die COVID-19-pandemie.
PCR vereis 'n komplekse termiese siklus wat nie geskik is vir POCT nie.Meer onlangs is isotermiese amplifikasie tegnieke toegepas op mikrofluidika, insluitend maar nie beperk nie tot LAMP, rekombinase polimerase amplifikasie (RPA) en amplifikasie gebaseer op nukleïensuurvolgordes [65,66,67,68].Met hierdie tegnieke word nukleïensure teen 'n konstante temperatuur versterk, wat die skepping van laekoste, hoogs sensitiewe draagbare POCT-toestelle vir molekulêre diagnostiek vergemaklik.
Hoë-deurset mikrofluidika-gebaseerde LAMP-toetse laat veelvuldige opsporing van aansteeklike siektes toe [42, 69, 70, 71].In kombinasie met 'n sentrifugale mikrofluïdiese stelsel, kan LAMP die outomatisering van nukleïensuuropsporing verder fasiliteer [69, 72, 73, 74, 75].Die spin-en-reageer SlipChip is ontwikkel vir die visuele opsporing van veelvuldige parallelle bakterieë met behulp van LAMP [76] (Fig. 4a).Wanneer geoptimaliseerde LAMP in die toets gebruik word, was die fluoressensie sein-tot-geraas verhouding ongeveer 5-voudig, en die opsporingslimiet het 7.2 kopieë/μl van genomiese DNA bereik. Verder is die bestaan van vyf algemene spysverteringsbakteriese patogene, insluitend Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis en Vibrio parahaemolyticus, gevisualiseer gebaseer op die metode in < 60 min. Verder is die bestaan van vyf algemene spysverteringsbakteriese patogene, insluitend Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis en Vibrio parahaemolyticus, gevisualiseer gebaseer op die metode in < 60 min.Boonop is die teenwoordigheid van vyf algemene bakteriese patogene van die spysverteringskanaal, insluitend Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis en Vibrio parahaemolyticus, met hierdie metode in minder as 60 minute gevisualiseer.此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 可 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 原体 的 存在 ， 包括 蜡状 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 沙门 氏 菌 、 河流 弧菌 和 副溶血性 弧菌。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 常见 消化道 细菌病 的 存在 ， 包括 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 弧菌 和 副溶血 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPDaarbenewens is die teenwoordigheid van vyf algemene bakteriële gastroïntestinale patogene, insluitend Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius en Vibrio parahaemolyticus, gevisualiseer met behulp van hierdie metode in minder as 60 minute.
Die voordele van LAMP in mikrofluidika sluit onder andere vinnige reaksie en geminiaturiseerde opsporing in.As gevolg van die reaksietemperatuur (ongeveer 70°C), word aërosols egter onvermydelik tydens LAMP gegenereer, wat lei tot 'n hoë vals positiewe tempo.Assay spesifisiteit, primer ontwerp, en temperatuur beheer moet ook geoptimaliseer word vir LAMP.Boonop is skyfieontwerpe wat veelvuldige teikenopsporing op 'n enkele skyfie implementeer van groot waarde en moet ontwikkel word.Daarbenewens is LAMP geskik vir veeldoelige opsporing geïntegreer in een skyfie, wat van groot belang is, maar daar is nog baie ruimte vir ontwikkeling.
Die hoë vals positiewe tempo van LAMP kan gedeeltelik verminder word met RPA, aangesien die relatief lae reaksietemperatuur (~37 °C) relatief min verdampingsprobleme tot gevolg het [77].In die RPA-stelsel begin twee teenoorgestelde primers DNA-sintese deur aan 'n rekombinase te bind en amplifikasie kan binne 10 minute voltooi word [78,79,80,81].Daarom is die hele RPA-proses baie vinniger as PCR of LAMP.In onlangse jare is getoon dat mikrofluïdiese tegnologie die spoed en akkuraatheid van RPA [82,83,84] verder verbeter.Byvoorbeeld, Liu et al.[85] het 'n mikrofluïdiese geïntegreerde laterale vloei-polimerase-rekombinase-amplifikasie-toets ontwikkel vir vinnige en sensitiewe opsporing van SARS-CoV-2 deur omgekeerde transkripsie RPA (RT-RPA) en 'n universele laterale vloei-toetsstrook-detectiestelsel te integreer.in 'n enkele mikrovloeistofstelsel.Figuur 4b).Die limiet van opsporing is 1 kopie/µl of 30 kopieë/monster, en opsporing kan binne ongeveer 30 minute voltooi word.Kong et al.het 'n draagbare mikrofluïdiese toestel ontwikkel.[86] het liggaamstemperatuur en 'n selfoongebaseerde fluoressensie-opsporingstelsel gebruik om MIV-1-DNS vinnig en direk met behulp van RPA op te spoor (Figuur 4c).Die draagbare RPA-toets bespeur 100 kopieë/ml van die teikenvolgorde binne 24 minute, wat groot potensiaal toon vir vinnige diagnose van MIV-1-geïnfekteerde babas in hulpbronbeperkte omgewings.
Isotermiese versterking in punt-van-sorg-toetsing (POCT).Ontwikkeling en produksie van spin en reaksie SlipChip.Na plasmasweiswerk is die boonste en onderste skyfies met 'n stel moere aanmekaargesit om die finale skyfie te vorm (aangepas vanaf [76]).b Skematiese van die MI-IF-RPA-stelsel vir COVID-19-opsporing (aangepas vanaf [85]).c Skematiese van 'n draagbare RPA-toets vir vinnige opsporing van MIV-1-DNS (aangepas uit [86]).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM carboxyfluorescein, menslike immuniteitsgebrekvirus MIV, RPA rekombinase polimerase amplifikasie, LED-liguitstralende diode, MI-IF-lae-geïntegreerde polimerase-polimerase-polimerase-polymerase Versterking
Mikrofluïdiese-gebaseerde RPA ontwikkel vinnig, maar die koste van skyfievervaardiging en reaksieverbruik is te hoog en moet verminder word om die beskikbaarheid van hierdie tegnologie te verhoog.Daarbenewens kan die hoë sensitiwiteit van RPA die versterking van nie-spesifieke produkte beïnvloed, veral in die teenwoordigheid van kontaminasie.Hierdie beperkings kan die toepassing van RPA in mikrovloeistofstelsels beïnvloed en verdien verdere optimalisering.Goed ontwerpte primers en probes vir verskeie teikens is ook nodig om die haalbaarheid van RPA-gebaseerde mikrofluïdiese strategieë in POCT te verbeter.
Cas13 en Cas12a het die vermoë om nukleïensure ewekansig te splits en kan dus ontwikkel word as opsporings- en diagnostiese hulpmiddels.Cas13 en Cas12a word geaktiveer by binding aan onderskeidelik teiken DNA of RNA.Sodra dit geaktiveer is, begin die proteïen om ander nabygeleë nukleïensure te splits, waarna gids-RNA's wat patogeen-spesifieke nukleïensure teiken, uitgebluste fluoresserende probes kan klief en fluoressensie kan vrystel.Op grond van hierdie teorie het Kellner et al.[87] het 'n Cas13-gebaseerde metode ontwikkel [Spesifieke Hoë-sensitiwiteit Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)], en Broughton et al.[88] het 'n ander benadering ontwikkel gebaseer op Cas12a [CRISPR Trans Reporter gerig op DNA-endonuklease (DTECR)].
In onlangse jare het verskeie metodes vir die opsporing van nukleïensure gebaseer op CRISPR verskyn [89, 90].Konvensionele CRISPR-gebaseerde metodes is dikwels tydrowend en arbeidsintensief as gevolg van veelvuldige prosedures, insluitend nukleïensuurekstraksie, amplifikasie en CRISPR-opsporing.Blootstelling van vloeistowwe aan lug kan die kans op vals positiewe resultate verhoog.Gegewe bogenoemde, benodig CRISPR-gebaseerde stelsels dringend optimalisering.
'n Pneumaties beheerde mikrofluïdiese platform wat 24 ontledings in parallel kan uitvoer, is ontwikkel vir CRISPR-Cas12a en CRISPR-Cas13a opsporing toepassings [91].Die stelsel is toegerus met 'n fluoressensie-opsporingstoestel wat nukleïensuurversterking omseil en outomaties femtomolêre DNA- en RNA-monsters opspoor.Chen et al.[92] geïntegreerde rekombinase-amplifikasie met die CRISPR-Cas12a-stelsel in sentrifugale mikrofluidika (Fig. 5a).Hierdie werk oorkom die moeilikheid om hierdie twee prosesse te integreer omdat Cas12a boodskapper-DNS kan verteer en die amplifikasieproses kan inhibeer.Daarbenewens het Chen et al.[92] het die reaksiereagense bykomend vooraf in 'n sentrifugale mikrovloeistofbeheer gestoor om die hele proses outomaties te voltooi.In 'n ander werk het Silva et al.[93] het 'n diagnostiese metode sonder CRISPR/Cas12a-versterking en 'n slimfoon ontwikkel om SARS-CoV-2 op te spoor (Fig. 5b).Hierdie toets, bekend as 'n selfoon-gebaseerde amplifikasie-vrye stelsel, sluit 'n CRISPR/Cas-afhanklike ensiem in wat gebaseer is op slimfoonvisualisering van katalase-gegenereerde borrelseine in mikrofluïdiese kanale.Sensitiewe opsporing van minder as 50 kopieë/µl nukleïensuur sonder pre-amplifikasie, die hele proses van monsterinspuiting tot seinlesing neem slegs 71 minute.
Nukleïensuur opsporing metodes gebaseer op CRISPR.Sentrifugale POCT vir geïntegreerde molekulêre diagnostiek gebaseer op CRISPR (aangepas uit [92]).b Ontwikkeling van die CASCADE-toets vir slimfoongebaseerde analise van SARS-CoV-2 (aangepas uit [93]).RAA-rekombinase-amplifikasie, PAM-aangrensende protospacer-motief, CRISPR-gegroepeerde kort palindromiese herhalings met gereelde tussenposes, CASCADE-stelsel sonder selfoonversterking met CRISPR/CAS-afhanklike ensieme, 1-etiel-3-[3-dimetielaminopropyl]karbodiimiedhidrochloried EDC
As die laaste stap in nukleïensuuropsporing, weerspieël seinopsporing diagnostiese resultate direk en is 'n kritieke faktor in die ontwikkeling van 'n doeltreffende, sensitiewe en akkurate POCT.Seine kan gelees word deur verskeie metodes soos fluoresserende, elektrochemiese, kolorimetriese en magnetiese strategieë te gebruik.In hierdie afdeling beskryf ons die rasionaal vir elke benadering en vergelyk die molekulêre diagnostiek van aansteeklike siektes in mikrofluidika.
Fluoresentasie-gebaseerde strategieë word wyd gebruik vir POCT diagnostiek van aansteeklike siektes as gevolg van hul merkwaardige voordele van uitstekende sensitiwiteit, lae koste, gemak van operasie en punt-van-sorg analise [94, 95].Hierdie strategieë gebruik gemerkte fluorofore soos fluoresserende kleurstowwe en nanomateriale om 'n waarneembare sein te skep (fluoressensieverbetering of -blus).Hierdie bevinding dui daarop dat fluoressensie-gebaseerde strategieë verdeel kan word in direkte fluoresserende etikettering, sein-aan en sein-af fluoresserende opsporing [96].Direkte fluoresserende etiketopsporing gebruik spesiale fluoresserende etikette om spesifieke ligande te merk wat 'n spesifieke hoeveelheid fluoressensie genereer wanneer dit selektief aan 'n teiken gebind word.Vir sein-gebaseerde fluoressensie-opsporing, is die kwaliteit van die fluoresserende sein positief verwant aan die grootte van belang.Fluoresensie-intensiteit is weglaatbaar in die afwesigheid van 'n teiken en is waarneembaar wanneer 'n voldoende hoeveelheid teiken teenwoordig is.Omgekeerd is die intensiteit van fluoressensie wat deur "sein-af" fluoressensie bespeur word omgekeerd eweredig aan die hoeveelheid teiken, wat aanvanklik 'n maksimum waarde bereik en geleidelik afneem soos die teiken vergroot word.Byvoorbeeld, met behulp van die CRISPR-Cas13a-teikenafhanklike trans-splitsingsmeganisme, Tian et al.[97] het 'n nuwe herkenningstrategie ontwikkel om RNA's op te spoor wat omgekeerde transkripsie direk omseil (Fig. 6a).By binding aan komplementêre teiken-RNA's, kan die CRISPR-Cas13-RNA-kompleks geaktiveer word, wat transkollaterale splitsing deur nie-spesifieke verslaggewer-RNA's veroorsaak.Die fluoresserend gemerkte verslaggewer [fluorofoor (F)] word deur die uitblusmiddel (Q) ongeskonde geblus en fluoresseer wanneer dit deur die geaktiveerde kompleks gesplits word.
Die voordeel van elektrochemiese opsporing is hoë opsporingspoed, maklike produksie, lae koste, maklik om te dra en outomatiese beheer.Dit is 'n kragtige analitiese metode vir POCT-toepassings.Gebaseer op grafeen veld-effek transistors Gao et al.[98] het 'n nanobiosensor ontwikkel vir die multipleksopsporing van Lyme-siekte-antigene van Borrelia burgdorferi-bakterieë met 'n opsporingslimiet van 2 pg/mL (Fig. 6b).
Kolorimetriese toetse is in POCT-toepassings gebruik, wat voordeel trek uit die voordele van oordraagbaarheid, lae koste, gemak van voorbereiding en visuele lees.Kolorimetriese opsporing kan die oksidasie van peroksidase of peroksidase-agtige nanomateriale, die samevoeging van nanomateriale, en die byvoeging van indikatorkleurstowwe gebruik om inligting oor die teenwoordigheid van teikennukleïensure in sigbare kleurveranderinge om te skakel [99, 100, 101].Veral goud nanopartikels word wyd gebruik in die ontwikkeling van kolorimetriese strategieë, en as gevolg van hul vermoë om vinnige en beduidende kleurveranderinge te veroorsaak, is daar toenemende belangstelling in die ontwikkeling van POCT kolorimetriese platforms vir in situ diagnose van aansteeklike siektes [102].Met 'n geïntegreerde sentrifugale mikrofluïdiese toestel [103] kan voedselgedraagde patogene in besmette melkmonsters outomaties op die vlak van 10 bakteriese selle opgespoor word, en die resultate kan binne 65 minute visueel gelees word (Fig. 6c).
Magnetiese waarnemingstegnieke kan analiete akkuraat opspoor met behulp van magnetiese materiale, en daar was die afgelope dekades aansienlike belangstelling in POCT-toepassings.Magnetiese waarnemingstegnieke het 'n paar unieke voordele soos laekoste magnetiese materiale eerder as duur optiese komponente.Die gebruik van 'n magnetiese veld verbeter egter opsporingsdoeltreffendheid en verminder monstervoorbereidingstyd [104].Daarbenewens toon die resultate van magnetiese ondersoek hoë spesifisiteit, sensitiwiteit en hoë sein-tot-geraas-verhouding as gevolg van die onbeduidende magnetiese agtergrondsein van biologiese monsters [105].Sharma et al.'n magnetiese tonnelaansluiting-gebaseerde biosensor geïntegreer in 'n draagbare mikroskyfieplatform.[106] vir multipleksopsporing van patogene (Fig. 6d).Biosensors bespeur sensitief subnanomolêre nukleïensure wat van patogene geïsoleer is.
Tipiese sein opsporing metode.Die konsep van hiperlokaliseerde opsporing van Cas13a (aangepas uit [97]).b Grafeen nanobiosensor FET in kombinasie met Lyme GroES scFv (aangepas uit [98]).c Kolorimetriese aanduidings vir multipleksopsporing van voedselgedraagde patogene in 'n sentrifugale mikrofluïdiese skyfie: nr. 1 en nr. 3 monsters met teikenpatogene, en nr. 2, nr. 4 en nr. 5 monsters sonder teikenpatogene (aangepas vanaf [103]) .d Biosensor gebaseer op 'n magnetiese tonnelaansluiting, insluitend 'n platform, 'n ingeboude blokkeerversterker, 'n beheereenheid en 'n kragtoevoer vir seinopwekking/-verkryging (aangepas vanaf [106]).GFET Graphene FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS Dimethicone, PMMA polimetiel methakrilaat
Ten spyte van die uitstekende eienskappe van bogenoemde opsporingsmetodes, het hulle steeds nadele.Hierdie metodes word vergelyk (tabel 1), insluitend sommige toepassings met besonderhede (voor- en nadele).
Met die ontwikkeling van mikrofluïdika, mikro-elektromeganiese stelsels, nanotegnologie en materiaalwetenskap, vorder die gebruik van mikrofluïdiese skyfies vir die opsporing van aansteeklike siektes voortdurend [55,96,107,108].Presiese manipulasie van miniatuurtoerusting en vloeistowwe dra by tot diagnostiese akkuraatheid en koste-effektiwiteit.Daarom, vir verdere ontwikkeling, is pogings aangewend om die skyfies te optimaliseer en op te gradeer, wat gelei het tot verskeie mikrofluïdiese skyfies met verskillende strukture en funksies.Hier stel ons kortliks verskeie algemene tipes mikrofluïdiese platforms bekend en vergelyk hul eienskappe (voor- en nadele).Daarbenewens fokus die meeste van die voorbeelde hieronder gelys hoofsaaklik op die bekamping van SARS-CoV-2.
LOCC's is die mees algemene geminiaturiseerde komplekse analitiese stelsels en hul bedrywighede is hoogs geminiaturiseer, geïntegreer, geoutomatiseer en geparalleliseer vanaf monsterinspuiting en voorbereiding, vloeibeheer en vloeistofopsporing [109, 110].Vloeistowwe word gemanipuleer deur noukeurig ontwerpte meetkunde en die interaksie van baie fisiese effekte soos drukgradiënte, kapillêre aksie, elektrodinamika, magnetiese velde en akoestiese golwe [111].LOCC toon uitstekende voordele in hoë-deurset sifting en veelvuldige opsporing, met vinnige analise spoed, klein steekproefgrootte, lae kragverbruik, en hoë bestuur en bedryf doeltreffendheid;LOCC-toestelle is egter baie delikaat, en vervaardiging, verpakking en koppelvlak.Multipleksing en hergebruik ondervind egter enorme probleme [96].In vergelyking met ander platforms het LOCC unieke voordele in terme van maksimum toepassingsdiversiteit en beste tegnologieversoenbaarheid, maar die nadele daarvan is ook duidelik, naamlik hoë kompleksiteit en swak herhaalbaarheid.Afhanklikheid van eksterne pompe, wat dikwels lywig en duur is, beperk hul gebruik in POCT verder.
Tydens die COVID-19-uitbraak het LOCC baie aandag geniet.Terselfdertyd is daar verskeie nuwe skyfies wat verskeie tegnologieë kombineer.Slimfone word byvoorbeeld nou wyd gebruik as draagbare ontledingstoestelle en het groot potensiaal vir LOCC-integrasie.Sun et al.[21] het 'n mikrofluïdiese skyfie vervaardig wat die multipleksering van spesifieke nukleïensuurvolgorde van vyf patogene moontlik maak, insluitend SARS-CoV-2, met behulp van LAMP en dit met 'n slimfoon ontleed binne 1 uur na die einde van die reaksie.As nog 'n voorbeeld, Sundah et al.[112] het 'n molekulêre skakelaar geskep [katalitiese versterking deur molekulêre oorgangstoestandskakelaar (CATCH)] vir direkte en sensitiewe opsporing van SARS-CoV-2 RNA-teikens met behulp van slimfone. CATCH is versoenbaar met draagbare LOCC en behaal uitstekende werkverrigting (ongeveer 8 RNA-kopieë/μl; < 1 uur by kamertemperatuur) [112]. CATCH is versoenbaar met draagbare LOCC en behaal uitstekende werkverrigting (ongeveer 8 RNA-kopieë/μl; < 1 uur by kamertemperatuur) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копий РНК/мкл; < 1 ч при комнатной температуре) [112]. CATCH is versoenbaar met draagbare LOCC en bied uitstekende deurset (ongeveer 8 RNA-kopieë/µl; < 1 uur by kamertemperatuur) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 尀温下 CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 尀温下 CATCH совместим с портативными LOCC en обладает превосходной производительностью (vir 8 копий РНКа/мкрим) [1 deel 1 deel] 1 deel 1 deel; CATCH is versoenbaar met draagbare LOCC's en het uitstekende werkverrigting (ongeveer 8 RNA-kopieë/µl; < 1 uur by kamertemperatuur) [112].Daarbenewens gebruik LOCC-toestelle vir molekulêre diagnostiek ook sekere dryfkragte soos vakuum, strek en elektriese velde.Kang et al.[113] het 'n intydse, ultravinnige nanoplasma-op-'n-skyfie PCR gedemonstreer vir vinnige en kwantitatiewe diagnose van COVID-19 in die veld met behulp van 'n vakuum plasmoniese vloeibare PCR-skyfie.Li et al.[114] het daarna 'n strekgedrewe mikrofluïdiese skyfie ontwikkel wat die diagnose van COVID-19 moontlik gemaak het.Die platform gebruik die RT-LAMP versterkingstelsel om te bepaal of 'n monster kwalitatief positief of negatief is.Vervolgens het Ramachandran et al.[115] het gepaste elektriese veldgradiënte bereik met behulp van isotachoforese (ITP), 'n selektiewe ioonfokuseringstegniek wat in mikrofluïdika geïmplementeer is.Met ITP kan teiken-RNA van rou nasofaryngeale deppermonsters outomaties gesuiwer word.Toe Ramachandran et al.[115] Deur hierdie ITP-suiwering met ITP-verbeterde LAMP- en CRISPR-toetse te kombineer, is SARS-CoV-2 in menslike nasofaryngeale depper en kliniese monsters in ongeveer 35 minute opgespoor.Boonop kom daar voortdurend nuwe idees na vore.Jadhav et al.[116] het 'n diagnostiese skema voorgestel wat gebaseer is op oppervlak-verbeterde Raman-spektroskopie in kombinasie met 'n mikrofluïdiese toestel wat óf vertikaal georiënteerde goud/silwer-bedekte koolstofnanobuise óf weggooibare elektrogespin mikro/nanobuise bevat.Membraan-gefunksionaliseerde ingeboude filter-mikrokanale is weggooibaar.Die toestel adsorbeer virusse van verskeie liggaamsvloeistowwe/afskeidings soos speeksel, nasofarynks en trane.Die virustiter is dus volop en die virus kan akkuraat geïdentifiseer word deur die Raman-handtekening.
LOAD is 'n sentrifugale mikrofluïdiese platform waarin alle prosesse beheer word deur 'n frekwensieprotokol wat 'n mikrogestruktureerde substraat roteer [110].Die LOAD-toestel word gekenmerk deur middel van sentrifugale krag as 'n belangrike dryfkrag.Vloeistowwe is ook onderhewig aan kapillêre, Euler- en Coriolis-kragte.Met behulp van 'n sentrifuge-toestel word ontledings uitgevoer in deurlopende vloeistofwerking vanaf 'n radiale inwaartse na uitwaartse posisie, wat die behoefte aan bykomende eksterne buise, pompe, aktuators en aktiewe kleppe uitskakel.Kortom, 'n enkele beheermetode vergemaklik werking.Die kragte wat op die vloeistof in dieselfde mikrofluïdiese kanaal op dieselfde afstand van die lasmiddelpunt inwerk, is gelyk, wat dit moontlik maak om die kanaalstruktuur te herhaal.LOAD-toerusting is dus eenvoudiger en meer ekonomies om te ontwerp en vervaardig as konvensionele LOCC-toerusting, terwyl die reaksies grootliks onafhanklik en geparalleliseer is;weens die hoë meganiese sterkte van sentrifugale toerusting is beskikbare chipmateriaal egter beperk en is klein volumes moeilik.na die kar toe.Terselfdertyd is die meeste LOAD-toestelle slegs vir eenmalige gebruik ontwerp, wat duur is vir grootskaalse opsporing [96, 117, 118, 119].
In onlangse dekades het LOAD, wat beskou word as een van die mees belowende mikrofluïdiese toestelle, aansienlike aandag van navorsers en vervaardigers gekry.LOAD het dus wye aanvaarding gekry en is gebruik vir molekulêre diagnostiek van aansteeklike patogene [120, 121, 122, 123, 124], veral tydens die COVID-19-uitbraak.Byvoorbeeld, aan die einde van 2020 het Ji et al.[60] het 'n direkte RT-qPCR-toets gedemonstreer vir vinnige en outomatiese parallelle opsporing van SARS-CoV-2 en griep A- en B-infeksies in keeldeppermonsters.Daarna het Xiong et al.[74] het 'n LAMP-geïntegreerde diskoïde mikrofluïdiese platform aangebied vir vinnige, akkurate en gelyktydige opsporing van sewe menslike respiratoriese koronavirusse, insluitend SARS-CoV-2, binne 40 minute.Vroeg in 2021 het de Oliveira et al.[73] het 'n polistireen toner sentrifugale mikrofluïdiese skyfie gedemonstreer, met die hand bedien met 'n vingerpunt rotator, vir RT-LAMP molekulêre diagnose van COVID-19.Vervolgens het Dignan et al.[39] het 'n outomatiese draagbare sentrifuge-mikrotoestel aangebied vir suiwering van SARS-CoV-2 RNA direk vanaf bukkale depperafdelings.Medved et al.[53] het 'n inlyn SARS-CoV-2 aërosolmonsterstelsel voorgestel met 'n klein volume roterende mikrofluïdiese fluoresserende skyfie met 'n opsporingslimiet van 10 kopieë/μL en 'n minimum siklusdrempel van 15 minute.Suarez et al.[75] het onlangs die ontwikkeling van 'n geïntegreerde modulêre sentrifugale mikrofluïdiese platform vir die direkte opsporing van SARS-CoV-2 RNA in hitte-geïnaktiveerde nasofaryngeale deppermonsters met behulp van LAMP aangemeld.Hierdie voorbeelde demonstreer die groot voordele en belofte van LOAD in die molekulêre diagnostiek van COVID-19.
In 1945 het Muller en Clegg [125] die eerste keer mikrofluïdiese kanale op papier aangebied deur filtreerpapier en paraffien te gebruik.In 2007 het die Whitesides-groep [126] die eerste funksionele papierplatform vir proteïen- en glukosetoetsing geskep.Papier het 'n ideale substraat vir mikrovloeistowwe geword.Die papier het inherente eienskappe soos hidrofilisiteit en poreuse struktuur, uitstekende bioversoenbaarheid, ligte gewig, buigsaamheid, voubaarheid, lae koste, gebruiksgemak en gerief.Klassieke µPAD's bestaan uit hidrofiele/hidrofobiese strukture wat op papiersubstrate gebou is.Afhangende van die driedimensionele struktuur, kan μPADs verdeel word in tweedimensionele (2D) en driedimensionele (3D) μPADs.2D µPAD's word vervaardig deur hidrofobiese grense te vorm om mikrofluïdiese kanale te vorm, terwyl 3D µPAD's gewoonlik gemaak word van stapels lae 2D mikrofluïdiese papier, soms deur papiervou, gliptegnieke, oop kanale en 3D-drukwerk [96].Waterige of biologiese vloeistowwe op die μPAD word hoofsaaklik beheer deur kapillêre krag sonder 'n eksterne kragbron, wat voorafberging van reagense, monsterhantering en multipleksopsporing vergemaklik.Akkurate vloeibeheer en multipleksopsporing word egter belemmer deur onvoldoende opsporingspoed, sensitiwiteit en herbruikbaarheid [96, 127, 128, 129, 130].
As 'n ongewone mikrofluïdiese platform, is μPAD wyd bevorder en ontwikkel vir die molekulêre diagnose van aansteeklike siektes soos HCV, MIV en SARS-CoV-2 [131, 132].Vir selektiewe en sensitiewe opsporing van HCV, Tengam et al.[133] het 'n nuwe biosensor ontwikkel wat gebaseer is op fluoresserende papier met behulp van 'n hoogs spesifieke nukleïensuursonde gebaseer op pirrolidinielpeptied.Nukleïensure word kovalent geïmmobiliseer op gedeeltelik geoksideerde sellulosepapier deur reduktiewe alkilering tussen aminogroepe en aldehiedgroepe, en opsporing is gebaseer op fluoressensie.Hierdie seine kan gelees word deur 'n spesiaal vervaardigde apparaat met 'n draagbare fluoresserende kamera in kombinasie met 'n selfoonkamera.Vervolgens het Lu et al.[134] het 'n papiergebaseerde buigsame elektrode ontwerp gebaseer op nikkel/goud nanopartikels/koolstofnanobuise/polivinielalkohol organometaalraamwerksamestellings vir MIV-teikenopsporing deur DNA-hibridisasie met behulp van metileenblou as 'n DNA-redoksaanwyser.Meer onlangs het Chowdury et al.[135] het 'n hipotetiese platformontwerp aangebied vir punt-van-sorg µPAD-toetsing deur gebruik te maak van rou pasiëntspeeksel in kombinasie met LAMP en draagbare beeldtegnologie vir COVID-19 analietopsporing.
Laterale vloeitoetse lei vloeistowwe deur kapillêre kragte en beheer vloeistofbeweging deur die benatbaarheid en eienskappe van poreuse of mikrogestruktureerde substrate.Die laterale vloei toestelle bestaan uit monster, konjugaat, broeikas en opsporing, en absorberende pads.Die nukleïensuurmolekules in die LFA herken spesifieke binders wat vooraf by die bindingsplek gestoor is en bind as komplekse.Soos die vloeistof deur die inkubasie- en opsporingsplate gaan, word die komplekse gevang deur die vangmolekules wat op die toets- en kontrolelyne geleë is, wat resultate toon wat direk met die blote oog gelees kan word.Gewoonlik kan LFA binne 2-15 minute voltooi word, wat vinniger is as tradisionele ontdekking.As gevolg van die spesiale meganisme vereis LFA min bewerkings en vereis nie bykomende toerusting nie, wat dit baie gebruikersvriendelik maak.Dit is maklik om te vervaardig en te miniaturiseer, en die koste van papiergebaseerde substrate is laer.Dit word egter slegs vir kwalitatiewe analise gebruik, en kwantitatiewe opsporing is baie moeilik, en die multiplekseringsvermoë en deurset is baie beperk, en slegs een voldoende nukleïensuur kan op 'n slag opgespoor word [96,110,127].
Alhoewel die meeste toepassings van LFA op immunotoetse gefokus is, is die gebruik van LFA vir molekulêre diagnostiek in mikrofluïdiese skyfies ook effektief en gewild [136].In die geval van hepatitis B-virus, MIV en SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] het 'n op-omskakeling nanopartikel LFA platform voorgestel en die veelsydigheid van hierdie geminiaturiseerde en draagbare platform gedemonstreer deur sensitiewe en kwantitatiewe opsporing van veelvuldige teikens soos HBV nukleïensuur.Daarbenewens het Fu et al.[138] het 'n nuwe LFA gedemonstreer gebaseer op oppervlak-verbeterde Raman-spektroskopie vir die kwantitatiewe analise van MIV-1-DNS by lae konsentrasies.Vir vinnige en sensitiewe opsporing van SARS-CoV-2, Liu et al.[85] het 'n mikrofluïdiese-geïntegreerde RPA laterale vloei-analise ontwikkel deur RT-RPA en 'n universele laterale vloei-detectiestelsel in 'n enkele mikrofluïdiese stelsel te kombineer.
Die toepassing van verskeie mikrofluïdiese platforms wissel na gelang van spesifieke studies, wat die vermoëns en voordele van die platforms ten volle benut.Met bekostigbare kleppe, pompe en kanale is LOCC die mees omvattende platform vir toepassingsdiversiteit en interoperabiliteit met die grootste ruimte vir ontwikkeling.Daarom hoop en beveel ons aan dat die nuutste studies by LOCC as 'n eerste poging uitgevoer word en dat die toestande geoptimaliseer word.Daarbenewens word verwag dat meer doeltreffende en akkurate metodes ontdek en in die stelsel gebruik sal word.LOAD blink uit in presiese beheer van vloeistowwe vanaf bestaande LOCC-toestelle en demonstreer unieke voordele in enkelaandrywings deur middel van sentrifugale krag sonder die behoefte aan eksterne aandrywers, terwyl parallelle reaksies apart en gesinchroniseer kan word.Dus, in die toekoms, sal LOAD die belangrikste mikrofluïdiese platform word met minder handbewerkings en meer volwasse en outomatiese tegnologieë.Die µPAD-platform kombineer die voordele van LOCC en papiergebaseerde materiaal vir laekoste, eenmalige gebruik diagnostiek.Daarom moet toekomstige ontwikkeling fokus op gerieflike en goed gevestigde tegnologieë.Daarbenewens is die LFA goed geskik vir die opsporing van blote oog, wat belowe om monsterverbruik te verminder en opsporing te bespoedig.'n Gedetailleerde platformvergelyking word in Tabel 2 getoon.
Digitale ontledings verdeel die monster in baie mikroreaktore, wat elkeen 'n diskrete aantal teikenmolekules bevat [139, 140].Digitale toetse bied aansienlike voordele vir die uitvoering van absolute kwantifisering deur duisende parallelle biochemiese eksperimente gelyktydig en individueel in mikronskaal kompartemente uit te voer eerder as in 'n aaneenlopende fase.In vergelyking met tradisionele mikrofluïdika, kan kompartementreaksies monstervolume verminder, reaksiedoeltreffendheid verhoog en maklik geïntegreer word met ander analitiese metodes sonder die behoefte aan kanale, pompe, kleppe en kompakte ontwerpe [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147] .Die volgende twee metodes word in digitale toetse gebruik om eenvormige en akkurate skeiding van oplossings te bewerkstellig, insluitend reagense en monsters soos selle, nukleïensure en ander deeltjies of molekules: (1) druppelemulsies wat vloeistof-koppelvlak-onstabiliteit ontgin;(2) skikkingsverdeling word uitgevoer deur die meetkundige beperkings van die toestel.In die eerste metode kan druppels wat reagense en monsters in mikrokanale bevat, geskep word deur passiewe metodes soos medestroom, kruisvloei, vloeifokusering, gefaseerde emulgering, mikrokanaalemulsifikasie en membrane deur viskose skuifkragte en emulgering met kanaalverandering.lokalisering [143, 145, 146, 148, 149] of die gebruik van aktiewe metodes [150, 151], wat addisionele energie inbring deur elektriese, magnetiese, termiese en meganiese beheer.In laasgenoemde benadering word die beste vloeistofvolume-uniformiteit in mikrofluïdiese kamers gedeel deur ruimtelike strukture van dieselfde grootte te hou, soos mikroputte en oppervlakskikkings [152,153,154].Veral, druppels is hoofvloeiafdelings wat ook gegenereer en gemanipuleer kan word op elektrode-skikkings gebaseer op digitale mikrofluidika (DMF).Elektrobenatting van diëlektrika is een van die bes bestudeerde DMF-teorieë, aangesien elektrobenatting van diëlektrika akkurate manipulasie van individuele druppels moontlik maak, wat die vorm van die vloeistof beheer en asimmetriese elektriese seine wat deur verskillende kante gaan [141, 144].Die hoofbewerkings met druppels in DMF sluit sortering, splitsing en samesmelting in [151, 155, 156], wat in verskeie velde van analise toegepas kan word, veral in molekulêre opsporing [157, 158, 159].
Digitale nukleïensuuropsporing is 'n derdegenerasie molekulêre diagnostiese tegnologie wat volg op konvensionele PCR en kwantitatiewe intydse PCR (qPCR), parallel met hoë-deurset-volgordebepaling en vloeibare biopsie.In die afgelope twee dekades het digitale nukleïensure vinnig ontwikkel op die gebied van molekulêre diagnostiek van aansteeklike patogene [160, 161, 162].Absolute kwantifisering van digitale nukleïensuuropsporing begin met die verpak van monsters en reagense in individuele kompartemente om te verseker dat elke teikenvolgorde dieselfde waarskynlikheid het om elke individuele kompartement binne te gaan.Teoreties kan aan elke afdeling verskeie teikenvolgorde toegeken word, of daar mag nie 'n onafhanklike mikroreaksiestelsel wees nie.Deur die verskillende waarnemingsmeganismes wat hierbo beskryf is, kan kompartemente met mikrobiese teikenreekse wat seine bo 'n sekere drempel genereer met die blote oog of deur 'n masjien gevisualiseer word en as positief gemerk word, terwyl ander kompartemente wat seine onder die drempel genereer as positief gemerk word. .negatiewes, wat die sein vir elke afdeling 'n boolean maak.Deur dus die aantal kompartemente wat geskep is en die tempo van positiewe resultate na die reaksie te bereken, kan die oorspronklike kopieë van die toetsmonsters ooreenstem met die Poisson-verspreidingsformule sonder die behoefte aan 'n standaardkromme, wat benodig word vir roetine-kwantitatiewe ontledings soos bv. as qPCR.[163] In vergelyking met tradisionele molekulêre diagnostiese metodes, het digitale nukleïensuuropsporing 'n hoër mate van outomatisering, hoër analisespoed en sensitiwiteit, minder reagense, minder kontaminasie en eenvoudiger ontwerp en vervaardiging.Om hierdie redes is die gebruik van digitale toetse, veral druppelgebaseerde metodes, vir molekulêre diagnostiek, wat amplifikasie- en seinuitleestegnieke kombineer, goed bestudeer tydens die kritieke uitbreek van SARS-CoV-2.Byvoorbeeld, Yin et al.[164] gekombineerde druppel digitale en vinnige PCR-metodes om die ORF1ab-, N- en RNase P-gene in SARS-CoV-2 in 'n mikrofluïdiese skyfie op te spoor.Die stelsel was veral in staat om 'n positiewe sein binne 115 sekondes te identifiseer, wat vinniger is as konvensionele PCR, wat die doeltreffendheid daarvan in punt-van-sorg opsporing aandui (Figuur 7a).Dong et al.[165], Sow et al.[157], Chen et al.[166] en Alteri et al.[167] het ook druppel digitale PCR (ddPCR) toegepas om SARS-CoV-2 in 'n mikrovloeistofstelsel op te spoor met indrukwekkende resultate.Om die opsporingsyfer verder te verbeter, het Shen et al.[168] het ddPCR-gebaseerde skyfiebeelding in so min as 15 s bereik sonder die gebruik van beeldstiktegnieke, wat die ddPCR-tegnologieproses van laboratorium tot toepassing versnel het.Nie net termiese amplifikasiemetodes soos PCR word toegepas nie, maar ook isotermiese amplifikasiemetodes word gebruik om reaksietoestande en vinnige reaksie te vereenvoudig.Lu et al.[71] het SlipChip vir druppelanalise ontwikkel, wat in staat is om druppels van verskillende groottes teen hoë digthede in een stap te genereer en SARS-CoV-2-nukleïensure met behulp van digitale LAMP te kwantifiseer (Figuur 7b).As 'n vinnig ontwikkelende tegnologie, kan CRISPR ook 'n belangrike rol speel in digitale nukleïensuuropsporing deur gerieflike kolorimetriese beelding sonder die behoefte aan bykomende nukleïensuurvlekke.Ackerman et al.'n kombinatoriese matriksreaksie ontwikkel vir multipleksevaluering van nukleïensure.[158] het 169 mensgeassosieerde virusse, insluitend SARS-CoV-2, opgespoor in druppels wat CRISPR-Cas13-gebaseerde nukleïensuuropsporingsreagense in 'n mikroputtoets bevat (Figuur 7c).Daarbenewens kan isotermiese versterking en CRISPR-tegnologie in dieselfde stelsel gebruik word om die voordele van beide te kombineer.Park et al.[169] 'n CRISPR/Cas12a digitale toets is ontwikkel in 'n kommersiële mikrofluïdiese skyfie vir die opsporing van onttrekte en hitte-gedood SARS-CoV-2 gebaseer op 'n enkel-fase RT-RPA met 'n korter en hoër sein-na-agtergrond opsporing tyd verhouding., wyer dinamiese omvang en beter sensitiwiteit (Fig. 7d).Sommige beskrywings van hierdie voorbeelde word in Tabel 3 gegee.
Tipiese digitale platform vir nukleïensuur opsporing.a Die vinnige digitale PKR-werkvloei bestaan uit vier sleutelstappe: monstervoorbereiding, verspreiding van die reaksiemengsel, amplifikasieproses en teikenkwantifisering (aangepas uit [164]).b Skematiese ontleding van SlipChip-druppels vir druppelvorming by hoë digtheid (aangepas vanaf [71]).c CARMEN-Cas werkvloeidiagram13 (aangepas vanaf [158]).d Oorsig van gevorderde digitale virusopsporing met CRISPR/Cas in een pot (aangepas vanaf [169]).W/O water-in-olie, polidimetielsiloksaan PDMS, PCR polimerase kettingreaksie, DAQ data-insameling, PID proporsionele integrale afgeleide, CARMEN kombinatoriese matriksreaksie vir multipleks nukleïensuur evaluasie, SARS-CoV-2, ernstige akute respiratoriese sindroom, koronavirus 2, RT Amplifikasie van omgekeerde transkriptase rekombinase polimerase-RPA, S/B sein in die agtergrond
Postyd: 15-Sep-2022
